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Apr 28, 2023

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Wissenschaftliche Berichte Band 12,

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 17209 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Täglich sterben Milliarden von Zellen im Körper ab und die von ihnen freigesetzten zellfreien Chromatinpartikel (cfChPs) gelangen in die extrazellulären Kompartimente des Körpers, darunter auch in den Kreislauf. Es ist bekannt, dass cfChPs leicht in gesunde Zellen eindringen, deren DNA schädigen und apoptotische und entzündliche Wege aktivieren. Wir haben die Hypothese aufgestellt, dass der lebenslange Angriff von cfChPs auf gesunde Zellen die zugrunde liegende Ursache des Alterns ist und dass die Alterung durch die Deaktivierung extrazellulärer cfChPs verzögert werden könnte. Letzteres kann durch Sauerstoffradikale verursacht werden, die beim Mischen der Nutrazeutika Resveratrol und Kupfer (R-Cu) entstehen. Die vorliegende Studie untersuchte, ob eine längere Verabreichung von R-Cu die biologischen Merkmale des Alterns verzögern würde. C57Bl/6-Mäuse wurden in drei gleiche Gruppen eingeteilt; Eine Gruppe wurde im Alter von 3 Monaten getötet und diente als junge Kontrolle. Den verbleibenden Mäusen wurde erlaubt, zu altern, und im Alter von 10 Monaten wurde der experimentellen Alterungsgruppe weitere 12 Monate lang zweimal täglich R-Cu durch orale Sondenernährung in einer Dosis von 1 mg/kg R und 0,1 μg/kg Cu ​​verabreicht. Der Kontrollaltersgruppe wurde 12 Monate lang zweimal täglich Wasser per Schlundsonde verabreicht. Tiere beider Gruppen wurden im Alter von 22 Monaten getötet. Die Behandlung mit R-Cu führte zu einer Verringerung mehrerer biologischer Alterungsmerkmale in Gehirnzellen, darunter Telomerabrieb, Amyloidablagerung, DNA-Schädigung, Apoptose, Entzündung, Seneszenz, Aneuploidie und mitochondriale Dysfunktion. Die R-Cu-Behandlung führte auch zu einer signifikanten Senkung der Blutspiegel von Glukose, Cholesterin und C-reaktivem Protein. Diese Ergebnisse legen nahe, dass cfChPs als globale Auslöser von Alterung und Neurodegeneration wirken könnten und dass der therapeutische Einsatz von R-Cu dazu beitragen könnte, gesundes Altern zu einem erreichbaren Ziel zu machen.

Mit zunehmender Lebenserwartung ist die Menschheit gleichzeitig mit einer Zunahme altersbedingter degenerativer Erkrankungen konfrontiert, die die Lebensqualität erheblich beeinträchtigen können. Schätzungen zufolge wird die Zahl der Menschen im Alter von 60 Jahren oder älter in den nächsten zehn Jahren weltweit um 38 % von 1 Milliarde auf 1,4 Milliarden ansteigen und damit die Zahl der Jugendlichen übersteigen1. Die Generalversammlung der Vereinten Nationen hat die Jahre 2021–2030 zum Jahrzehnt des gesunden Alterns erklärt, mit dem ultimativen Ziel, therapeutische Interventionen zu finden, die gleichzeitig die vielen mit dem Altern verbundenen Erkrankungen verzögern1,2. Es wird argumentiert, dass gesundes Altern als die ultimative Präventionsmedizin betrachtet werden sollte3. Das Altern ist durch eine Vielzahl pathologischer Prozesse gekennzeichnet, die zu einer allmählichen Verschlechterung der Struktur und Funktion aller Zellen und Gewebe des Körpers führen4 und ist mit einer Vielzahl degenerativer Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit5, Herz-Kreislauf-Erkrankungen6, Diabetes7 und Krebs8 verbunden. Obwohl viele Theorien zum Altern aufgestellt wurden9,10, kann keine die zahlreichen Veränderungen, die mit diesem mehrdimensionalen Prozess einhergehen, umfassend erklären.

DNA-Schäden und chronische Entzündungen sind zwei Hauptmerkmale des Alterns11,12. In diesem Zusammenhang haben wir berichtet, dass zellfreie Chromatinpartikel (cfChPs), die aus den Milliarden von Zellen, die täglich im Körper sterben, freigesetzt werden und in die extrazellulären Kompartimente des Körpers gelangen, von gesunden Zellen leicht internalisiert werden können Sie verursachen dsDNA-Brüche, aktivieren apoptotische Wege und induzieren entzündliche Zytokine13,14. Dies hat uns zu der Hypothese geführt, dass wiederholte lebenslange Angriffe von cfChPs auf gesunde Zellen die zugrunde liegende Ursache für das Altern sein könnten15,16. Unsere Gruppe hat erfolgreich cfChPs aus menschlichem Serum isoliert und charakterisiert, die bei der EM-Untersuchung eine erhebliche Größenheterogenität zwischen ~ 10 und ~ 1000 nm aufwiesen13. Wir haben auch berichtet, dass der Blutspiegel von cfChPs mit zunehmendem Alter ansteigt17.

Unsere vorklinischen Studien haben zur Identifizierung einer neuartigen prooxidativen Kombination der Nutrazeutika Resveratrol (R) und Kupfer (Cu) geführt, die cfChPs über Sauerstoffradikale deaktiviert18,19,20. R ist ein bekanntes Antioxidans, dessen gesundheitliche Vorteile umfassend erforscht wurden21. Überraschenderweise wirkt es jedoch in Gegenwart von Cu als Prooxidans, das ebenfalls ein weithin erforschtes Nutrazeutikum ist22. Fukuhara et al.23 berichteten als erste, dass beim Mischen von R und Cu Sauerstoffradikale entstehen. Sie zeigten, dass R als Katalysator für die Reduktion von Cu (II) zu Cu (I) fungiert, was zur Bildung von Sauerstoffradikalen führt, die die DNA24 des Plasmids pBR322 spalten. Wir haben diese Ergebnisse erweitert, um zu zeigen, dass eine Kombination aus R und Cu genomische DNA und RNA25 abbauen und cfChPs in vivo durch Abbau ihrer DNA-Komponente deaktivieren kann18,19,20,25. Wir haben außerdem beobachtet, dass paradoxerweise die DNA-abbauende Aktivität von R-Cu zunimmt, wenn die molare Konzentration von Cu im Vergleich zu R25 allmählich verringert wird. Auf der Grundlage dieser Erkenntnis haben wir in der vorliegenden Studie das Molverhältnis von R:Cu bei 1:10–4 belassen.

Wir haben berichtet, dass eine Kombination aus R und Cu, wenn sie in einem Molverhältnis von 1:10–4 verwendet wird, therapeutische Wirkungen bei mehreren präklinischen Erkrankungen hat, die mit erhöhten extrazellulären Spiegeln von cfChPs verbunden sind18,19,20. Beispielsweise kann oral verabreichtes R-Cu toxische Nebenwirkungen von Chemotherapie18 und Strahlentherapie19 lindern und durch bakterielles Endotoxin verursachte Zytokinstürme und Todesfälle bei Mäusen verhindern20. Unsere ersten Ergebnisse legen auch nahe, dass R-Cu beim Menschen therapeutisch wirksam ist. Eine Beobachtungsstudie zeigte, dass die orale Verabreichung von R-Cu an Patienten mit schwerem Covid-19 zu einer Verringerung der Mortalität um fast 50 % führte26. Wir haben auch berichtet, dass Mukositis Grad III–IV durch oral verabreichtes R-Cu bei Patienten, die eine Hochdosis-Chemotherapie und eine Knochenmarktransplantation wegen multiplem Myelom erhielten, deutlich reduziert werden konnte27. Die Behandlung mit R-Cu führte in dieser Studie auch zu einer signifikanten Verringerung der Blutspiegel entzündlicher Zytokine.

Sauerstoffradikale, die bei der oralen Verabreichung von R-Cu entstehen, werden offenbar vom Magen absorbiert und haben systemische Wirkungen in Form der Deaktivierung/Eradikation extrazellulärer cfChPs18,19,20,26,27. In der vorliegenden Studie haben wir die Deaktivierungseigenschaft von R-Cu durch cfChP genutzt, um zu untersuchen, ob eine längere Verabreichung von R-Cu an alternde Mäuse die Merkmale des Alterns und der Neurodegeneration verzögert. Die in unserer Studie verwendete R-Dosis betrug 1 mg/kg und die Cu-Dosis 0,1 μg/kg, verabreicht durch eine orale Sonde zweimal täglich. Diese Cu-Dosis war 20.000-mal geringer und die von R 5-mal geringer als jene, die von anderen Forschern in vorklinischen Studien zur Untersuchung ihrer gesundheitsfördernden Eigenschaften verwendet wurden28,29.

Mittels konfokaler Mikroskopie und Antikörpern gegen DNA und Histon konnten wir das reichliche Vorkommen extrazellulärer cfChPs im Gehirn alternder Mäuse nachweisen und beobachten, dass cfChPs nach längerer oraler Verabreichung von R-Cu deaktiviert/ausgelöscht wurden. Die Deaktivierung/Eradikation von cfChPs war mit einer Herunterregulierung mehrerer biologischer Alterungsmerkmale in Gehirnzellen verbunden. Auf systemischer Ebene führte die R-Cu-Behandlung zu einer signifikanten Senkung der Blutspiegel von Glukose, Cholesterin und C-reaktivem Protein. Zusammengenommen legen unsere Ergebnisse nahe, dass cfChPs als globale Auslöser von Alterung und Neurodegeneration wirken und dass der therapeutische Einsatz von R-Cu dazu beitragen kann, gesundes Altern zu einem erreichbaren Ziel zu machen.

Das Versuchsprotokoll dieser Studie wurde vom Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) des Advanced Centre for Treatment, Research and Education in Cancer (ACTREC), Tata Memorial Centre, Navi Mumbai, Indien, mit der Genehmigung Nr. 16/2015 genehmigt. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Tiersicherheitsrichtlinien der IAEC und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

ACTREC-IAEC pflegt eine respektvolle Behandlung, Pflege und Nutzung von Tieren in der wissenschaftlichen Forschung. Ziel ist es, dass der Einsatz von Tieren in der Forschung zur Weiterentwicklung des Wissens im Einklang mit ethischen und wissenschaftlichen Notwendigkeiten beiträgt. Alle an dieser Studie beteiligten Wissenschaftler und Techniker haben eine Schulung im ethischen Umgang und Management von Tieren unter Aufsicht eines FELASA-zertifizierten behandelnden Tierarztes absolviert. Die Tiere wurden zu geeigneten Zeitpunkten unter CO2-Atmosphäre durch Zervixluxation unter Aufsicht von FELASA-geschultem Tierhaltungspersonal eingeschläfert.

Die Quellen für R und Cu waren: Resveratrol (Handelsname – TransMaxTR, Biotivia LLC, USA (https://www.biotivia.com/product/transmax/); Kupfer (Handelsname – Chelated Copper, JR Carlson Laboratories Inc. USA (https://carlsonlabs.com/chelated-copper/).

Von der Institutional Animal Facility stammende Inzucht-C57Bl/6-Mäuse wurden gemäß den Standards unseres Institutional Animal Ethics Committee gehalten. Sie wurden in pathogenfreien Käfigen mit Schaleneinstreu unter einem 12-stündigen Licht-/Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Wasser und Futter gehalten. Das HVAC-System wurde verwendet, um Raumtemperatur, Luftfeuchtigkeit und Luftdruck zu kontrollieren.

Die Studie umfasste 24 C57Bl/6-Mäuse, von denen 12 männlich und 12 weiblich waren. Vier Mäuse beiderlei Geschlechts wurden im Alter von drei Monaten getötet und dienten als junge Kontrollen. Die verbleibenden 16 Mäuse (8 männliche und 8 weibliche) durften altern, bis sie 10 Monate alt waren, und wurden in zwei Gruppen eingeteilt: (1) alternde Kontrollmäuse (N = 4 von jedem Geschlecht) und (2) mit R-Cu behandelte Mäuse alternde Mäuse (N = 4 von jedem Geschlecht). Tiere beider Gruppen wurden nach 12 Monaten im Alter von 22 Monaten getötet.

R-Cu wurde 12 Monate lang (von 10 bis 22 Monaten) zweimal täglich per oraler Sonde in einer Dosis von 1 mg/kg R und 0,1 μg/kg Cu ​​verabreicht. Da R wasserunlöslich ist, wurde es als Wassersuspension (100 μl) und Cu als wasserbasierte Lösung (100 μl) verabreicht. Den alternden Kontrollmäusen wurde zweimal täglich Wasser (100 μl) per oraler Sonde verabreicht. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass diese Dosis R-Cu bei mehreren anderen präklinischen Erkrankungen therapeutisch wirksam ist18,19,20.

Reduzierte körperliche Aktivität und Gewichtsverlust der Mäuse wurden als humane Endpunkte der Studie verwendet und zweimal pro Woche bewertet. Zu geeigneten Zeitpunkten, wie oben angegeben, wurde Blut auf retroorbitalem Weg unter Isoflurananästhesie zur Serumtrennung gesammelt. Anschließend wurden die Tiere unter CO2-Atmosphäre durch Genickbruch unter Aufsicht von FELASA-geschultem Tierhaltungspersonal eingeschläfert. Nach der Euthanasie wurde allen Tieren das Gehirn entnommen, in 10 % Formalin fixiert und Paraffinblöcke für die weitere Analyse vorbereitet.

Einzelheiten zu kommerziellen Quellen und Katalognummern der in dieser Studie verwendeten Reagenzien, Antikörper und Analysekits sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Die Expression von SOD in Gehirnzellen wurde mithilfe der Immunfluoreszenztechnik (IF) geschätzt, wie von uns zuvor beschrieben18,20. Kurz gesagt, FFPE-Schnitte wurden entparaffiniert, in Alkoholreihen rehydratisiert, in 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0) 20 Minuten lang bei 95 °C inkubiert und in 1X PBS gewaschen. Die Schnitte wurden unter Verwendung eines Primärantikörpers gegen SOD und eines entsprechenden Sekundärantikörpers immungefärbt (Ergänzungstabelle 1). Die Bilder wurden mit der FISH View-Software Version 8.1 (https://spectral-imaging.com, Applied Spectral Imaging, Israel) aufgenommen und analysiert.

Die Serum-SOD-Aktivität wurde durch ELISA unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Cell Biolabs, CA, USA; Kat.-Nr. # STA 340) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

Eine Immunfärbung auf DNA und Histon H4 mit anschließender konfokaler Mikroskopie wurde an formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Abschnitten des Gehirns durchgeführt, wie von uns zuvor ausführlich beschrieben20. Die Fluoreszenzintensität von fünf zufällig ausgewählten konfokalen Feldern (~ 50 Zellen in jedem Feld) wurde aufgezeichnet und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) (± SEM) geschätzt.

Die durchschnittliche Telomerlänge aus dem Gehirngewebe wurde mithilfe einer hochempfindlichen quantitativen Echtzeit-PCR-Technik (qRT-PCR) geschätzt30,31. Genomische DNA wurde mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) aus Hirngewebe isoliert. Die DNA-Quantifizierung wurde mit einem Nanodrop™-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) durchgeführt. Zehn Nanogramm DNA wurden in 5 µl 1 × SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 250 nM beider telomerspezifischer Primer oder 350 nM 36B4-Primer für ein Gesamtvolumen von 10 µl Reaktionen verwendet. Die Temperaturwechselbedingungen für Telomere und 36B4 sind: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C für 15 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden. Die Sequenz für telomerspezifische Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Sigma-Aldrich) ist 5' CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT 3' und 5' GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT 3 '. Die Sequenzen für saures ribosomales Phosphoprotein (36B4) – spezifische Vorwärts- und Rückwärtsprimer sind 5‘ ACT GGT CTA GGA CCC GAG AAG 3‘ bzw. 5‘TCA ATG GTG CCT CTG GAG ATT 3‘). Aus der Milz einer einzelnen Maus isolierte genomische DNA wurde als Referenz-DNA verwendet und für die Telomer- und 36B4-PCR seriell verdünnt. Alle Proben wurden in zweifacher Ausfertigung auf einem QuantStudio™ 12 K Flex Real-Time PCR System (ThermoFisher) unter Verwendung eines 384-Well-Blocks untersucht. Es wurden Standardkurven erstellt und die relative Eingabemenge sowohl für Telomer als auch für 36B4 berechnet. Der Durchschnitt des Verhältnisses von Telomeren und 36B4 wurde als durchschnittliche Telomerlänge angegeben.

Quantitative Telomer-FISH wurde unter Verwendung von Cy3-markierten Peptidnukleinsäure (PNA)-Telomersonden durchgeführt (Ergänzungstabelle 1). FFPE-Gehirnschnitte wurden entparaffiniert und seriell in Reihen mit absolutem Ethanol (70/80/100 %) dehydriert, gefolgt von der Antigengewinnung in Natriumcitratpuffer (pH 6) bei 90 °C im Wasserbad und abgekühlt auf Raumtemperatur. Die Schnitte wurden in einer Alkoholreihe dehydriert und 6 Minuten lang bei 75 °C denaturiert. Die Schnitte wurden dann über Nacht bei 37 °C mit PNA-Telomersonden hybridisiert. Ungebundene Sonden wurden mit 2X Kochsalzlösung (SSC)-Puffer und anschließend 4X SSC bei 56 °C jeweils 3 Minuten lang gewaschen. Die Schnitte wurden schließlich in 4-fachem Salzlösungs-Natriumcitrat-Tween-20-Puffer (SSCT) bei Raumtemperatur gewaschen und in VectaShield DAPI montiert. Die Bilder wurden mit dem Applied Spectral Bio-Imaging-System (Applied Spectral Imaging, Israel) aufgenommen und analysiert. Bilder von ~ 500 Interphasenkernen wurden mit der SpotScan Software 8.1 (https://spectral-imaging.com, Applied Spectral Imaging, Israel) in einem Mehrkanal-3D-Modus mit einer konstanten Belichtung von 1000 ms für Cy3 (Telomere) und 150 ms aufgenommen ms für DAPI (Kerne) während der Experimente. Jedes 3D-Bild bestand aus einem Stapel von 11 Brennebenen pro Zelle mit einem Abtastabstand von 500 nm in z-Richtung und 107 nm in xy-Richtung. Die Bilder wurden entfaltet und die Telomerzahlen pro Kern mithilfe des Spot Count-Algorithmus in der SpotView-Software 8.1 (https://spectral-imaging.com, Applied Spectral Imaging, Israel) geschätzt. Die Anzahl der Telomeraggregate pro Kern wurde visuell geschätzt.

Der Nachweis von Amyloidablagerungen im Gehirn wurde durch konfokale Mikroskopie an FFPE-Schnitten nach Fluoreszenz-Immunfärbung unter Verwendung eines Primärantikörpers gegen β-Amyloid und eines geeigneten Sekundärantikörpers untersucht (Ergänzungstabelle 1). Serum-BDNF wurde durch ELISA unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Ergänzungstabelle 1) gemäß den Anweisungen des Herstellers geschätzt.

Die Expression von γ-H2AX, aktiver Caspase-3 und NF-kB wurde auf FFPE-Schnitten von Hirngewebe mit der Standard-IF-Methode unter Verwendung geeigneter Antikörper (Ergänzungstabelle 1) analysiert, wie von uns zuvor beschrieben18,20.

Die Bewertung von Seneszenz-Biomarkern wurde an FFPE-Schnitten von Hirngewebe durchgeführt und umfasste Folgendes: (1) Co-Lokalisierung von Telomer- und γ-H2AX-IF-Signalen unter Verwendung von Immuno-FISH; (2) Co-Lokalisierung von 53BP1- und pro-myelozytischen Leukämie-Kernkörperchen (PML-NBs) IF-Signalen; (3) p16INK4a-Expression durch IF unter Verwendung geeigneter Antikörper.

Die Aneuploidie wurde im Hinblick auf die Chromosomennummern 7 und 16 mittels FISH unter Verwendung chromosomenspezifischer Sonden an FFPE-Schnitten von Hirngewebe beurteilt. Die Schnitte wurden in Alkoholreihen (70–100 %) entparaffiniert und dehydriert, gefolgt von einer Antigengewinnung in Natriumcitratpuffer (pH 6) bei 90 °C im Wasserbad und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Schnitte wurden über Nacht bei 37 °C mit Chromosom 7- und 16-spezifischen DNA-Sonden hybridisiert. Ungebundene Sonden wurden mit 2X SSC und anschließend 0,4X SSC bei 70 °C jeweils 3 Minuten lang abgewaschen. Die Schnitte wurden schließlich in 4X SSCT gewaschen und in VectaShield DAPI montiert. Die Bilder wurden mit dem Applied Spectral Bio-Imaging-System (Applied Spectral Imaging, Israel) aufgenommen und analysiert. Die Anzahl der Fluoreszenzsignale pro Kern wurde gezählt und Signale von mehr oder weniger als 2 N wurden als Beweis für Aneuploidie gewertet. Fünf Felder mit etwa 500 Kernen wurden analysiert und die durchschnittliche Anzahl von Signalen pro Kern berechnet.

Die mitochondriale Dysfunktion wurde mittels IF an FFPE-Schnitten von Hirngewebe analysiert, um die Expression des mitochondrialen Transmembranproteins TOMM20 zu beurteilen. Die Schätzung volumetrischer Änderungen in der TOMM20-Expression wurde mit der IMARIS-Software 7.2.3 (http://www.bitplane.com, Bitplane Technologies, AG) durchgeführt. Das mittlere Volumen (in x-y-z-Ebenen) wurde für 5 Bilder (> 2.000 Mitochondrien) für jeden Gehirnabschnitt berechnet.

Die Serumglukose- und Cholesterinwerte wurden mithilfe eines automatisierten Instruments (Dimension EXL mit LM, Siemens) geschätzt. Die Konzentrationen des C-reaktiven Proteins (CRP) im Serum wurden mit einem kommerziellen ELISA-Kit (Ergänzungstabelle 1) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen.

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 6.0 (https://www.graphpad.com/, GraphPad Software, Inc., USA) durchgeführt. Die Ergebnisse von gealterten Kontrollmäusen wurden mit jungen Kontrollmäusen und gealterten + R-Cu-behandelten Mäusen verglichen. Mittelwerte (± SEM) für vier Mäuse in jeder Gruppe für beide Geschlechter wurden unter Verwendung des nichtparametrischen ungepaarten Student-T-Tests getrennt für beide Geschlechter verglichen.

Die Studie wurde vom Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) des Advanced Center for Treatment, Research and Education in Cancer (ACTREC) genehmigt. ACTREC IAEC hält sich an die ARRIVE-Richtlinien. Die Experimente in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt (Ergänzungstabelle 2).

In einem ersten Schritt untersuchten wir, ob eine orale R-Cu-Behandlung möglicherweise zur Bildung freier Radikale im Gehirn geführt hat. Wie erwartet zeigten alternde Mäuse eine signifikante Verringerung der SOD-Werte in Gehirnzellen (p < 0,05 bzw. p < 0,01 bei weiblichen bzw. männlichen Mäusen) (Abb. 1). Die R-Cu-Behandlung führte jedoch zu einem deutlichen Anstieg der SOD-Werte, der dem bei jungen Kontrollmäusen (p < 0,01 sowohl bei weiblichen als auch bei männlichen Mäusen) vergleichbar war (Abb. 1). Dieser Befund deutete darauf hin, dass nach der R-Cu-Behandlung offenbar in vivo Sauerstoffradikale erzeugt wurden und in Gehirnzellen eingedrungen zu sein schienen. Letzterer hatte bei dem Versuch, die eindringenden Sauerstoffradikale zu eliminieren, einen antioxidativen Abwehrmechanismus aktiviert, indem er das antioxidative Enzym SOD hochregulierte. Es ist jedoch zu beachten, dass die IF-Methode, die wir zum Nachweis der SOD-Expression in Gehirnzellen verwendet haben, nicht deren biologische Aktivität widerspiegelt. Die Behandlung mit R-Cu führte jedoch zu einem Anstieg der SOD-Aktivität im Serum alternder Mäuse und brachte sie auf ähnliche Werte wie bei jungen Kontrollmäusen (p < 0,01 bzw. p < 0,05 bei weiblichen und männlichen Mäusen) (Ergänzung). Abbildung S1). Basierend auf der erhöhten SOD-Aktivität im Serum bei mit R-Cu behandelten Mäusen kann angenommen werden, dass die SOD-Aktivität auch in Gehirnzellen zugenommen hat.

Verlust der SOD-Aktivität in Gehirnzellen alternder Mäuse und ihre Wiederherstellung durch R-Cu-Behandlung. Repräsentative IF-Bilder der SOD-Expression in Gehirnzellen (oberes Feld) (Maßstabsbalken = 10 µm) und Quantifizierung der SOD-Werte ausgedrückt als Histogramme (unteres Feld). Für jeden Objektträger wurden 1000 Zellen analysiert und der Prozentsatz SOD-positiver Zellen berechnet. Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar. N = 4 Tiere in jeder Gruppe beiderlei Geschlechts. Die Werte junger Kontrollmäuse und mit R-Cu behandelter alternder Mäuse wurden mit denen alternder Kontrollmäuse verglichen und eine statistische Analyse wurde mit dem zweiseitigen Student-t-Test durchgeführt. *p < 0,05; **p < 0,01.

Nach einer fluoreszierenden Immunfärbung mit Anti-DNA- (rot) und Anti-Histon-Antikörpern (grün) wurde eine konfokale Mikroskopie von FFPE-Schnitten des Gehirns alternder Mäuse durchgeführt. Bei der Überlagerung von DNA- und Histon-Fluoreszenzbildern wurde das reichliche Vorhandensein von cfChPs (gelbe Fluoreszenzsignale) in den extrazellulären Räumen des Gehirns alternder Mäuse nachgewiesen (Abb. 2). cfChPs wurden nach einjähriger R-Cu-Behandlung praktisch eliminiert. Dieser Befund deutete indirekt darauf hin, dass im Mausgehirn erzeugte Sauerstoffradikale offenbar die Fülle an cfChPs, die in den extrazellulären Räumen des alternden Mausgehirns vorhanden waren, deaktiviert/ausgelöscht hatten. Aus Abb. 2 ist zu erkennen, dass nicht alle roten (DNA) und grünen (Histon) Fluoreszenzsignale streng kolokalisiert waren. Dies könnte auf Unebenheiten der Schnittflächen der FFPE-Schnitte zurückzuführen sein, die den jeweiligen Antikörpern den Zugang zu den DNA- und Histon-Epitopen auf cfChPs verwehrten. Die Quantifizierung des MFI gelb fluoreszierender cfChPs-Signale zeigte eine bemerkenswerte Verringerung der cfChPs in extrazellulären Räumen des alternden Gehirns nach einjähriger Behandlung mit R-Cu (p < 0,01 bei beiden Geschlechtern) (Abb. 2).

Reichliches Vorkommen von cfChPs in extrazellulären Räumen des alternden Gehirns und deren Deaktivierung/Eradikation durch R-Cu-Behandlung. Repräsentative konfokale Bilder von FFPE-Schnitten nach fluoreszierender Immunfärbung mit Anti-DNA- (rot) und Anti-Histon-Antikörpern, die die Co-Lokalisierung von roten und grünen Signalen zeigen, um gelb/weiß gefärbte Partikel zu erzeugen, die cfChPs darstellen (linkes Feld). Quantifizierung der gelben ZF-Signale, ausgedrückt als Histogramme (rechtes Feld). Die Fluoreszenzintensität von fünf zufällig ausgewählten konfokalen Feldern (~ 50 Zellen in jedem Feld) aus jedem Abschnitt wurde aufgezeichnet. Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar. N = 4 Tiere in jeder Gruppe beiderlei Geschlechts. Die Werte junger Kontrollmäuse und mit R-Cu behandelter alternder Mäuse wurden mit denen alternder Kontrollmäuse verglichen und eine statistische Analyse wurde mit dem zweiseitigen Student-t-Test durchgeführt. **p < 0,01, ***p < 0,001.

Telomere spielen eine zentrale Rolle bei zellulären Veränderungen im Zusammenhang mit dem Alter32. Telomerabrieb, Telomerverlust und Telomeraggregation sind Hauptmerkmale des Alterns32,33. Wir schätzten die Telomerlänge in Gehirnzellen mittels qRT-PCR und beobachteten eine signifikante Verringerung der Telomerlänge bei Mäusen beiderlei Geschlechts (p < 0,0001 bzw. p < 0,01 bei weiblichen bzw. männlichen Mäusen) (Abb. 3A). Die Behandlung mit R-Cu stellte die Telomerlänge bei weiblichen Mäusen in signifikantem Maße wieder her (p < 0,001), bei männlichen Mäusen jedoch nicht (Abb. 3A). In Bezug auf die Anzahl der Telomersignale pro Gehirnzelle wurde bei alternden Mäusen beiderlei Geschlechts eine Verringerung beobachtet (p < 0,01 bei beiden Geschlechtern), die sich nach der R-Cu-Behandlung bei weiblichen Mäusen erneut signifikant erholte (p < 0,01), bei jedoch nicht männliche Mäuse (Abb. 3B, C). Eine ähnliche Beobachtung wurde in Bezug auf die Aggregation von Telomeren gemacht, die bei alternden Mäusen beiderlei Geschlechts signifikant erhöht war (p < 0,001 bzw. p < 0,01 bei weiblichen bzw. männlichen Mäusen), jedoch nach der R-Cu-Behandlung nur bei signifikant verringert war weibliche Mäuse (p <0,01) (Abb. 3B, D). Insgesamt erwies sich R-Cu im Hinblick auf Telomeranomalien als wirksam bei der Wiederherstellung von Telomeranomalien bei weiblichen, nicht aber bei männlichen Mäusen.

Telomeranomalien in Gehirnzellen alternder Mäuse und ihre Vorbeugung durch Behandlung mit R-Cu. (A) Schätzung der Telomerlänge durch quantitative RT-PCR. Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar. N = 4 Tiere beiderlei Geschlechts, außer bei mit R-Cu behandelten weiblichen Mäusen, bei denen N = 3 war; (B) Repräsentative Bilder von Telomer-FISH (Maßstabsbalken = 10 µm). (C) Histogramme, die die Anzahl der Telomere pro Kern darstellen, geschätzt mit SpotScan Software 8.1 (https://spectral-imaging.com, Applied Spectral Imaging, Israel). Die durchschnittliche Anzahl fluoreszierender Telomersignale pro Kern aus fünf zufällig ausgewählten Feldern (~ 500 Kerne) wird in den Histogrammen dargestellt. Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar. N = 4 Tiere je Gruppe beiderlei Geschlechts; (D) Histogramme, die Telomeraggregate pro Kern darstellen (gekennzeichnet durch Pfeilspitzen in B). Die durchschnittliche Anzahl fluoreszierender Telomeraggregate pro Kern aus fünf zufällig ausgewählten Feldern (~ 500 Kerne) ist in den Histogrammen dargestellt. Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar. N = 4 Tiere je Gruppe beiderlei Geschlechts. In (A,C,D)-Werte bei jungen Kontrolltieren und mit R-Cu behandelten alternden Mäusen wurden mit denen alternder Kontrollen verglichen und eine statistische Analyse wurde mit dem zweiseitigen Student-t-Test durchgeführt. **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001.

Eine erhöhte Ablagerung von Amyloid (Aβ)-Protein in extrazellulären Räumen von Gehirnzellen wird klassischerweise mit der Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht34,35. Konfokale Mikroskopie mit Antikörpern gegen β-Amyloid zeigte eine deutlich erhöhte Amyloidablagerung in Form von Amyloidfibrillen bei alternden Mäusen. Letzteres war nach einjähriger R-Cu-Behandlung deutlich reduziert (Abb. 4A, linkes Feld). Die Quantifizierung von MFI bestätigte den deutlichen Anstieg der extrazellulären β-Amyloid-Ablagerung im Gehirn alternder Mäuse (p < 0,0001 und p < 0,01 bei weiblichen bzw. männlichen Mäusen). Eine einjährige Behandlung mit R-Cu führte zu einer signifikanten Verringerung des extrazellulären Amyloids bei Mäusen beiderlei Geschlechts (p < 0,01 bzw. p < 0,5 bei weiblichen bzw. männlichen Mäusen) (Abb. 4A, rechte Tafel).

Erhöhte β-Amyloid-Ablagerung im alternden Gehirn und verringerter BDNF im Serum, die beide durch die Behandlung mit R-Cu rückgängig gemacht werden. (A) Repräsentative konfokale Bilder der β-Amyloid-Ablagerung im Gehirn, nachgewiesen durch IF (linkes Feld). Quantitative Histogramme, die mittlere MFI-Werte (± SEM) der β-Amyloid-Fluoreszenz darstellen (rechtes Feld). Für jede Folie wurde der von 1000 Zellen bedeckte Gehirnbereich analysiert. N = 4 Tiere in jeder Gruppe beiderlei Geschlechts. (B) Quantitative Histogramme, die mittlere Serum-BDNF-Spiegel darstellen (± SEM). N = 4 Tiere in jeder Gruppe beiderlei Geschlechts, mit Ausnahme der jungen Kontrollmäuse (N = 3), der alternden R-Cu-behandelten Weibchen (N = 3) und der alternden männlichen Kontrollmäuse (N = 3). Sowohl in (A) als auch in (B) wurden die Werte junger Kontrolltiere und mit R-Cu behandelter alternder Tiere mit denen alternder Kontrollen verglichen und eine statistische Analyse wurde mit dem zweiseitigen Student-t-Test durchgeführt. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001.

Der aus dem Gehirn stammende neurotrophe Faktor (BDNF), der eine wichtige Rolle für das Überleben und Wachstum von Neuronen36 spielt, war laut ELISA-Messung in Seren alternder Mäuse beiderlei Geschlechts stark reduziert (p < 0,01 bzw. p < 0,05 bei weiblichen und männlichen Mäusen). (Abb. 4B). Die einjährige Behandlung mit R-Cu führte dazu, dass die Serum-BDNF-Spiegel nahezu denen junger Mäuse beiderlei Geschlechts entsprachen (p < 0,05 bzw. p < 0,001 bei weiblichen bzw. männlichen Mäusen) (Abb. 4B).

Als nächstes untersuchten wir mehrere andere Merkmale des Alterns, nämlich. DNA-Schäden, Apoptose und Entzündungen in Gehirnzellen37,38,39. DNA-Schäden wurden mithilfe der Phosphorylierung von H2AX als Marker für dsDNA-Brüche untersucht40. Die γ-H2AX-Spiegel waren bei alternden Mäusen deutlich erhöht (p < 0,001 und p < 0,0001 bei weiblichen bzw. männlichen Mäusen). Die R-Cu-Behandlung reduzierte die γ-H2AX-Spiegel (p < 0,01 bzw. p < 0,05 bei weiblichen bzw. männlichen Mäusen) (Abb. 5A, linke und rechte Tafel).

DNA-Schäden, Apoptose und Entzündungen in Gehirnzellen alternder Mäuse und deren Vorbeugung durch Behandlung mit R-Cu. (A) Repräsentative Bilder des γH2AX-Ausdrucks (Maßstabsbalken = 10 µm) (linkes Feld). Quantitative Histogramme (rechtes Feld). Für jeden Objektträger wurden 1000 Zellen analysiert und der Prozentsatz der für γH2AX positiven Zellen berechnet. Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar. N = 4 Tiere in jeder Gruppe beiderlei Geschlechts. (B) Repräsentative Bilder des aktiven Caspase-3-Ausdrucks (Maßstabsbalken = 10 µm) (linkes Feld). Quantitative Histogramme (rechtes Feld). Für jeden Objektträger wurden 1000 Zellen analysiert und der Prozentsatz der für Caspase-3 positiven Zellen berechnet. Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar. N = 4 Tiere in jeder Gruppe beiderlei Geschlechts. (C) Repräsentative Bilder der NF-kB-Expression (Maßstabsbalken = 10 µm) (linkes Feld). Quantitative Histogramme (rechtes Feld). Für jeden Objektträger wurden 1000 Zellen analysiert und der Prozentsatz der NF-kB-positiven Zellen berechnet. Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar. N = 4 Tiere in jeder Gruppe beiderlei Geschlechts. Für (A–C) wurden die Werte bei jungen Kontrolltieren und mit R-Cu behandelten alternden Tieren mit denen alternder Kontrollen verglichen und eine statistische Analyse wurde mit dem zweiseitigen Student-t-Test durchgeführt. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001.

Als nächstes untersuchten wir die aktiven Caspase-3-Spiegel, die bekanntermaßen ein Marker für mitochondrienvermittelte Apoptose sind41. Bei beiden Geschlechtern wurde ein hochsignifikanter Anstieg der Apoptose in alternden Gehirnzellen beobachtet (p < 0,0001). Die Behandlung mit R-Cu reduzierte den Grad der Apoptose bei Mäusen beiderlei Geschlechts signifikant (p < 0,01 bzw. p < 0,0001 bei weiblichen bzw. männlichen Mäusen) (Abb. 5B, linke und rechte Tafel).

Entzündungen sind ein Hauptmerkmal des Alterns12, und wir haben die Expression des Transkriptionsfaktors NF-kB in Gehirnzellen untersucht. Letzteres war bei alternden Mäusen beiderlei Geschlechts hochsignifikant erhöht (p < 0,0001). Die R-Cu-Behandlung reduzierte die NF-kB-Spiegel bei beiden Geschlechtern signifikant (p < 0,05 bzw. p < 0,01 bei weiblichen bzw. männlichen Mäusen) (Abb. 5C, linke und rechte Tafel).

Seneszenz ist das Kennzeichen des biologischen Alterns, das durch eine allmähliche Verschlechterung der Zellfunktionen gekennzeichnet ist42. Wir beobachteten das Fortbestehen zahlreicher kolokalisierender Signale von γ-H2AX mit denen von Telomeren (DNA-SCARS) – ein klassisches Kennzeichen der Seneszenz43 – bei alternden Mäusen beiderlei Geschlechts (p < 0,001). Die Quantifizierung der Co-Lokalisierungssignale ergab eine deutliche Verringerung nach der R-Cu-Behandlung (p < 0,01 bei beiden Geschlechtern) (Abb. 6A, obere und untere Tafel).

Aktivierung von Seneszenzmerkmalen in Gehirnzellen alternder Mäuse und deren Vorbeugung durch Behandlung mit R-Cu. (A) Repräsentative Immuno-FISH-Bilder, die die Co-Lokalisierung von Fluoreszenzsignalen von γ-H2AX und Telomeren (oberes Feld) zeigen (Maßstabsbalken = 10 µm). Histogramme der quantitativen Schätzung co-lokalisierter Signale (unteres Feld). Für jeden Objektträger wurden 500 Kerne analysiert und der Prozentsatz der Zellen berechnet, die eine Co-Lokalisierung von γH2AX- und Telomersignalen zeigten. Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar. N = 4 Tiere in jeder Gruppe beiderlei Geschlechts. (B) Repräsentative IF-Bilder, die die Co-Lokalisierung von Fluoreszenzsignalen von 53BP1 und PML (linkes Feld) zeigen (Maßstabsbalken = 10 µm). Histogramme der quantitativen Schätzung kolokalisierter Signale (rechtes Feld). Für jeden Objektträger wurden 500 Kerne analysiert und der Prozentsatz der Zellen berechnet, die eine Co-Lokalisierung von 53BP1- und PML-Signalen zeigten. Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar. N = 4 Tiere in jeder Gruppe beiderlei Geschlechts. (C) Repräsentative Bilder des p16-Ausdrucks (oberes Feld) (Maßstabsbalken = 10 µm) und quantitative Histogramme (unteres Feld). Für jeden Objektträger wurden 1000 Zellen analysiert und der Prozentsatz p16-positiver Zellen berechnet. Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar. N = 4 Tiere in jeder Gruppe beiderlei Geschlechts. In (A–C) wurden die Werte junger Kontrolltiere und mit R-Cu behandelter alternder Tiere mit denen alternder Kontrollen verglichen und eine statistische Analyse wurde mit dem zweiseitigen Student-t-Test durchgeführt. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001.

Doppelstrang-DNA-Brüche bilden einen Speicherknotenpunkt für mehrere Heterochromatin-bindende Proteine ​​in Form von seneszenzassoziierten heterochromatischen Herden (SAHF)44. Ein solches Heterochromatin-bindendes Protein sind pro-myelozytische Leukämie-Kernkörperchen (PML-NBs), von denen gezeigt wurde, dass sie bei alternden Mäusen signifikant mit der durch DNA-Schäden verbundenen Seneszenz korrelieren45,46. Wir zeigen, dass die Anzahl der kolokalisierenden Signale von 53BP1 und PML bei alternden Mäusen beiderlei Geschlechts deutlich erhöht war (p < 0,0001). Co-Lokalisierungssignale wurden nach einjähriger R-Cu-Behandlung signifikant reduziert (p < 0,05 bzw. p < 0,01 bei weiblichen bzw. männlichen Mäusen) (Abb. 6B, linke und rechte Tafel).

Ein weiterer von uns untersuchter Seneszenzmarker war p16 INK4a 47, der bei alternden Mäusen beiderlei Geschlechts erhöht war (p < 0,0001 für beide Geschlechter). Die R-Cu-Behandlung reduzierte die p16 INK4a-Spiegel signifikant (p < 0,05 bzw. p < 0,01 bei weiblichen bzw. männlichen Mäusen) (Abb. 6C, obere und untere Tafel).

Der Verlust von Telomeren, der bei alternden Mäusen zur Verschmelzung von Chromosomen führt, kann zu Aneuploidie führen, was zu einer abnormalen Anzahl von Chromosomen führt48. Wir untersuchten den Grad der Aneuploidie in Gehirnzellen in Bezug auf Chromosom Nr. 7 und 16 und beobachteten einen etwa 15-fachen Anstieg der Aneuploidie bei alternden Mäusen in Bezug auf beide Chromosomen (p < 0,0001 für beide Chromosomen bei beiden Geschlechtern) (Abb. 7). , linke und rechte Seite). Die R-Cu-Behandlung reduzierte die Aneuploidie in Bezug auf beide Chromosomen bei beiden Geschlechtern deutlich (p < 0,001)) (Abb. 7, linke und rechte Tafel).

Entwicklung von Aneuploidie in Gehirnzellen alternder Mäuse und ihre Vorbeugung durch Behandlung mit R-Cu. Repräsentative Bilder der Aneuploidie von Chromosom 7 und Chromosom 16 in Gehirnzellen (linke Felder) (Maßstabsbalken = 10 µm). Quantitative Histogramme, die den Prozentsatz aneuploider Zellen darstellen (rechte Tafel). Die Anzahl der Fluoreszenzsignale pro Kern wurde gezählt und Signale von weniger als 2 N oder mehr als 2 N in einem Kern wurden als Beweis für Aneuploidie gewertet. Fünf Felder (~ 500 Kerne) wurden analysiert und die durchschnittliche Anzahl von Signalen pro Kern berechnet. Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar. N = 4 Tiere in jeder Gruppe beiderlei Geschlechts. Die Werte bei jungen Kontrolltieren und mit R-Cu behandelten alternden Tieren wurden mit denen alternder Kontrollen verglichen und die statistische Analyse wurde mit dem zweiseitigen Student-t-Test durchgeführt. ***p < 0,001; ****p < 0,0001.

Mitochondriale DNA-Integrität und -Funktionalität nehmen mit zunehmendem Alter ab, was zur Anhäufung oxidativer Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) führt49. Wir untersuchten die mitochondriale Dysfunktion, indem wir die Expression von TOMM20 analysierten, einer nuklear kodierten Untereinheit des mitochondrialen Translokationskomplexes, die andere nuklear kodierte Proteine ​​importiert. Es wird berichtet, dass seine Überexpression die Neurodegeneration fördert50. Unsere Ergebnisse zeigten eine Überexpression von TOMM20 auf der Mitochondrienmembran, die im Vergleich zu jungen Kontrollpersonen zu einem Anstieg des gesamten Mitochondrienvolumens in alternden Gehirnzellen führte (p < 0,001 bei beiden Geschlechtern). Die R-Cu-Behandlung stellte das Mitochondrienvolumen signifikant wieder her (p < 0,05 bzw. p < 0,01 bei weiblichen bzw. männlichen Mäusen) (Abb. 8, obere und untere Tafel).

Erhöhte mitochondriale Dysfunktion bei alternden Mäusen und deren Vorbeugung durch Behandlung mit R-Cu. Repräsentative IF-Bilder, die die Expression von TOMM20 zeigen (oberes Feld) (Maßstabsbalken = 10 µm). Quantitative Histogramme, die mitochondriale Volumenänderungen darstellen (unteres Feld). Fünf Felder (~ 2000 Mitochondrien) wurden analysiert und die durchschnittliche volumetrische Änderung wurde mit der IMARIS-Software 7.2.3 (http://www.bitplane.com, Bitplane Technologies, AG) geschätzt. Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar. N = 4 Tiere in jeder Gruppe beiderlei Geschlechts. Die Werte bei jungen Kontrolltieren und mit R-Cu behandelten alternden Tieren wurden mit denen alternder Kontrollen verglichen und die statistische Analyse wurde mit dem zweiseitigen Student-t-Test durchgeführt. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.

Bei der metabolischen Alterung kommt es zu einer Fehlregulation physiologischer Prozesse, die zu Insulinresistenz und Lipidansammlung führt, die durch chronische Entzündungen geringen Ausmaßes verursacht werden51,52. Wie erwartet war der Serumglukosespiegel bei alternden Mäusen signifikant erhöht53 (p < 0,01 für beide Geschlechter) und sank nach einjähriger Behandlung mit R-Cu auf Werte, die bei jungen Kontrollpersonen beobachtet wurden (p < 0,01 für beide Geschlechter) (Abb. 9A). ). Das Serumcholesterin war bei alternden weiblichen Mäusen signifikant erhöht (p < 0,05), bei männlichen Mäusen jedoch nicht (Abb. 9B). Das Serumcholesterin war bei alternden weiblichen Mäusen signifikant erhöht (p < 0,05), bei männlichen Mäusen jedoch nicht (Abb. 9B). Dennoch senkte die R-Cu-Behandlung den Serumcholesterinspiegel bei beiden Geschlechtern signifikant (p < 0,001 und p < 0,05 bei weiblichen bzw. männlichen Mäusen). CRP war bei alternden Mäusen beiderlei Geschlechts hochsignifikant erhöht (p < 0,0001) und wurde durch R-Cu-Behandlung reduziert (p < 0,05 bei beiden Geschlechtern) (Abb. 9C).

Erhöhte Stoffwechselstörungen bei alternden Mäusen und deren Vorbeugung durch Behandlung mit R-Cu. (A–C) stellen Histogramme der Serumglukose-, Cholesterin- und CRP-Werte dar. Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar. N = 4 Tiere in jeder Gruppe beiderlei Geschlechts, mit Ausnahme der weiblichen Cholesterin-Jungtiere (N = 3) und der männlichen Cholesterin-Jungtiere (N = 2). Die Werte bei jungen Kontrolltieren und mit R-Cu behandelten alternden Tieren wurden mit denen alternder Kontrollen verglichen und die statistische Analyse wurde mit dem zweiseitigen Student-t-Test durchgeführt. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001.

ROS sind kurzlebige molekulare Spezies, die ein ungepaartes Elektron enthalten, was sie bei der Suche nach einem anderen Elektron zur Paarung hochreaktiv macht und dabei Biomoleküle wie DNA, Proteine ​​und Lipide schädigen kann54. Es ist bekannt, dass ROS-induzierter oxidativer Stress vielfältige schädliche Auswirkungen auf Wirtszellen hat55. Wir haben jedoch berichtet, dass ROS, wenn sie außerhalb der Zelle in den extrazellulären Räumen des Körpers künstlich erzeugt werden, paradoxerweise weitreichende therapeutische Wirkungen haben können18,19,20,26,27. Das Mischen von R mit Cu führt aufgrund der Fähigkeit von R, Cu (II) zu Cu (I)23,25 zu reduzieren, zur Bildung von Sauerstoffradikalen. Sauerstoffradikale, die im Magen bei oraler Verabreichung von R-Cu erzeugt werden, werden offenbar absorbiert und haben systemische Wirkungen in Form der Deaktivierung/Eradikation extrazellulärer cfChPs. Wir haben gezeigt, dass cfChPs weitreichende schädigende Auswirkungen auf Wirtszellen haben. Beispielsweise können cfChPs leicht in gesunde Zellen eindringen, deren DNA schädigen, entzündliche Zytokine aktivieren und die Apoptose über den mitochondrialen Weg fördern13,14. Angesichts der Tatsache, dass täglich 1 × 109–1 × 1012 Zellen im Körper absterben56,57, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass wiederholte und lebenslange Angriffe auf gesunde Zellen durch cfChPs, die aus den sterbenden Zellen stammen, die zugrunde liegende Ursache für das Altern sein könnten15,16. Zur Untermauerung dieser Hypothese zeigen wir in diesem Artikel, dass eine längere orale Verabreichung von R-Cu an alternde Mäuse aufgrund seiner Fähigkeit, cfChPs zu deaktivieren, mehrere biologische Merkmale des Alterns und der Neurodegeneration herunterregulierte. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass R-Cu als ideales Anti-Aging-Mittel gelten könnte, da es das Potenzial hat, die vielen mit dem Altern verbundenen Erkrankungen gleichzeitig zu verzögern oder zu verzögern2. Um weltweit einsetzbar zu sein, sollte ein ideales Anti-Aging-Mittel auch kostengünstig und ungiftig sein – die beiden Kriterien, die auch R-Cu erfüllt. Letzteres lässt sich leicht oral verabreichen und sowohl R als auch Cu sind bereits für den menschlichen Gebrauch zugelassen. Eine illustrierte Zusammenfassung des Studiendesigns und der Mechanismen, durch die durch R-Cu erzeugte Sauerstoffradikale cfChPs aus der Mikroumgebung des Gehirns vernichten, was zu einer Herunterregulierung der Alterungsmerkmale führt, ist in Abb. 10 dargestellt.

Grafische Darstellung des Studiendesigns und der Mechanismen, die an der durch Sauerstoffradikale induzierten Herunterregulierung biologischer Merkmale der Alterung in Gehirnzellen nach einer R-Cu-Behandlung beteiligt sind. (A) cfChPs, die aus dem Blutkreislauf diffundieren oder lokal aus sterbenden Gehirnzellen freigesetzt werden, werden von gesunden Gehirnzellen leicht internalisiert, wobei sie mehrere biologische Merkmale des Alterns aktivieren. (B) Bei der oralen Verabreichung von R-Cu werden im Magen Sauerstoffradikale erzeugt, die leicht absorbiert werden und zu systemischen Effekten in Form der Deaktivierung/Eradikation von cfChPs in der Mikroumgebung des Gehirns führen. Die Deaktivierung/Eradikation von cfChPs führt zu einer Herunterregulierung biologischer Alterungsmerkmale in Gehirnzellen. Sauerstoffradikale dringen auch in die gesunden Gehirnzellen ein; Ihr Eintritt führt jedoch zur Aktivierung des antioxidativen Enzyms Superoxiddismutase (SOD), das die schädlichen Stoffe entgiftet und eliminiert und so die genomische DNA schützt.

Die Mechanismen, durch die R-Cu die vielfältigen biologischen Merkmale des Alterns und der Neurodegeneration herunterreguliert, müssen näher erläutert werden. Die Umkehrung der Telomerverkürzung durch R-Cu könnte darauf hindeuten, dass die Telomerverkürzung eine Folge von DNA-Schäden sein könnte, die durch cfChPs verursacht werden, die Telomerenden abscheren und so zu einer Verkürzung führen. Wir beobachteten unterschiedliche Auswirkungen zwischen weiblichen und männlichen Mäusen in Bezug auf Telomeranomalien. Die R-Cu-Effekte bei der Verhinderung von Telomeranomalien bei weiblichen Mäusen waren für alle getesteten Parameter statistisch signifikant, während dies bei männlichen Mäusen nicht der Fall war. Die biologische Erklärung für diesen abweichenden Befund muss noch ermittelt werden. Der Bruch von Telomerenden könnte auch dazu beitragen, unsere Erkennung von persistierenden γ-H2AX-Signalen in Telomerregionen von Gehirnzellen (DNA-SCARS) zu erklären – ein etabliertes Zeichen der Seneszenz43. Die bloßen Chromosomenenden können miteinander verschmelzen, was zu Chromosomeninstabilität und Aneuploidie48 führt, wie in unserer Studie festgestellt wurde. Im Hinblick auf die mitochondriale Dysfunktion haben wir kürzlich berichtet, dass internalisierte cfChPs nicht nur die genomische DNA schädigen, sondern auch die Mitochondrien physisch schädigen können58. Einer der in dieser Studie festgestellten Indikatoren für mitochondriale Schäden war die Hochregulierung von TOMM2058. Unser Befund in der vorliegenden Studie zur TOMM20-Überexpression bei alternden Mäusen und deren Umkehrung durch R-Cu steht im Einklang mit der Möglichkeit, dass mitochondriale Schäden bei alternden Mäusen durch cfChPs induziert werden, die aus sterbenden Gehirnzellen freigesetzt werden. Eine Verringerung der Amyloid-Plaque-Bildung nach längerer R-Cu-Behandlung lässt jedoch auf eine unbekannte Rolle von cfChPs schließen, die weiterer Forschung bedarf. Ebenso sind die Mechanismen, durch die R-Cu die Stoffwechselstörung bei alternden Mäusen reduzierte und zu einer Verringerung der Serumspiegel von Glukose, Cholesterin und CRP führte, derzeit unbekannt. Zusammenfassend lässt sich der Schluss ziehen, dass cfChPs pleiotrope Wirkungen mit weitreichenden Auswirkungen auf Alterung und Neurodegeneration haben, die für zukünftige Forschung offen bleiben.

Wir haben keine Hinweise auf eine Schädigung der genomischen DNA von Gehirnzellen festgestellt, die auf Sauerstoffradikale zurückzuführen sein könnte, die nach einjähriger R-Cu-Behandlung erzeugt werden. Das deutlich hochregulierte antioxidative Enzym SOD in R-Cu-behandelten Mäusen neutralisierte offenbar die eindringenden Sauerstoffradikale und verhinderte eine Schädigung der zellulären genomischen DNA (siehe Abb. 1). Somit führt der Eintritt von durch R-Cu erzeugten Sauerstoffradikalen in Gehirnzellen zu einer Hochregulierung von SOD, was wiederum das Genom vor ROS-induzierten oxidativen Schäden schützt. Dies wurde durch unsere Feststellung einer Verringerung der γ-H2AX-Signale bei den mit R-Cu behandelten Mäusen weiter untermauert (siehe Abb. 5A). Insgesamt beobachteten wir bei Mäusen, denen über einen Zeitraum von einem Jahr R-Cu verabreicht wurde, keine nachteiligen Auswirkungen. Dies deutete darauf hin, dass die Genome aller Körperzellen durch hochregulierte antioxidative Enzyme in ähnlicher Weise vor den potenziell schädlichen Auswirkungen von Sauerstoffradikalen geschützt wurden.

Unsere Studie weist einige Einschränkungen auf. Es geht beispielsweise nicht auf die Auswirkungen von R-Cu auf physiologische Funktionen wie das Gedächtnis oder Verhaltensaspekte der Tiere ein oder darauf, ob es das Überleben verlängert. Die Auswirkungen einer Beendigung der R-Cu-Exposition wurden ebenfalls nicht untersucht; Ob die beobachteten Veränderungen rückgängig gemacht werden oder verschwinden würden, ist unbekannt. Die Studie geht auch nicht darauf ein, ob das Phänomen der Hormesis an den von uns beobachteten biologischen Wirkungen beteiligt ist59,60. Dieses Problem ist besonders relevant, da wir niedrige Dosen von R und Cu verwendet haben, von denen berichtet wurde, dass sie beide hormetische Wirkungen aufweisen61,62. Es wurde berichtet, dass ein erfolgreiches Ansprechen auf die R-Therapie auf deren hormetischen Wirkungen beruht: positive Wirkungen bei niedrigen Dosen und zytotoxische Wirkungen bei höheren Dosen61. In Bezug auf Cu hat sich gezeigt, dass eine vorherige Behandlung von Tieren mit niedrigen Dosen sie vor höheren tödlichen Dosen von Cu62 schützt. Wir liefern keinen direkten Beweis dafür, dass das Mischen von R mit Cu aufgrund der Fähigkeit von R, Cu(II) zu Cu(I) zu reduzieren, zur Bildung von Sauerstoffradikalen führt. Die von uns beobachtete Deaktivierung von cfChPs in extrazellulären Räumen des Gehirns geht davon aus, dass dies durch Sauerstoffradikale bewirkt wird; Wir können das Vorhandensein von Sauerstoffradikalen im Gehirn von Mäusen nicht tatsächlich nachweisen. Unser Befund einer erhöhten SOD-Aktivität im Serum von mit R-Cu behandelten Mäusen lässt jedoch vermuten, dass möglicherweise auch Sauerstoffradikale im Gehirn erzeugt wurden. Wir haben auch nicht den Mechanismus untersucht, durch den Sauerstoffradikale aus dem Magen absorbiert werden, oder ob sie gegen cfChPs reagieren. Schließlich beobachteten wir, dass die Behandlung mit R-Cu zu einer Erhöhung der SOD-Expression in Gehirnzellen führt. Dies bedeutet nicht unbedingt eine erhöhte SOD-Aktivität.

Es wird angenommen, dass Alterung eine Folge von oxidativem Stress ist, der zu einem fortschreitenden Verlust von Gewebe- und Organfunktionen aufgrund der Anhäufung von ROS-induzierten Schäden führt63,64. Allerdings hat die antioxidative Therapie zur Verzögerung des Alterns in Tiermodellen zu widersprüchlichen Ergebnissen geführt65,66, und die Ergebnisse beim Menschen waren nicht eindeutig67. Von allen Antioxidantien wurde Resveratrol als Anti-Aging-Wirkstoff am häufigsten untersucht68. Unsere aktuellen Ergebnisse legen die Hypothese nahe, dass die berichteten Anti-Aging-Effekte von Resveratrol tatsächlich auf seiner prooxidativen Aktivität in Gegenwart von Kupfer beruhen könnten. Die widersprüchlichen Ergebnisse spiegeln möglicherweise die inkonsistente Verfügbarkeit von Kupfer im Magen wider, damit Resveratrol eine anhaltende prooxidative Aktivität ausübt, um extrazelluläre cfChPs wirksam zu deaktivieren und eine Schutzwirkung gegen Alterung zu erzielen.

Wir zeigen zum ersten Mal, dass aus sterbenden Gehirnzellen stammende cfChPs in den extrazellulären Räumen des alternden Gehirns reichlich vorhanden sind. Wir zeigen auch, dass extrazelluläre cfChPs durch Sauerstoffradikale, die nach längerer Behandlung mit R-Cu entstehen, praktisch eliminiert werden. Die Tatsache, dass die Eliminierung von cfChPs mit einer Herunterregulierung mehrerer biologischer Merkmale des Alterns und der Neurodegeneration verbunden war, ist ein starkes Argument für eine direkte Rolle von cfChPs bei der Ätiologie dieser pathologischen Prozesse. Wir schlagen vor, dass cfChPs, die aus sterbenden Gehirnzellen freigesetzt werden, einen Teufelskreis aus mehr DNA-Schäden, Apoptose und Entzündungen auslösen und einen minderwertigen und unerbittlichen „Zytokinsturm“ in Gang setzen69. Wir schlagen vor, dass Letzteres zusammen mit anderen bisher unbekannten schädlichen pleiotropen Wirkungen von cfChPs die zugrunde liegenden Prozesse sind, die das Altern definieren. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass diese schädlichen Auswirkungen durch die Deaktivierung/Eliminierung der störenden cfChPs über das Medium Sauerstoffradikale verhindert werden können. Wir schlagen vor, dass die orale Verabreichung einer Kombination kleiner Mengen von R und Cu das Potenzial hat, eine wirksame Anti-Aging-Therapiekombination zu sein. Ob R-Cu das Altern und die Neurodegeneration beim Menschen wirksam verzögern kann, muss auf klinische Studien in geeigneten Populationen warten. In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass unsere ersten Ergebnisse gezeigt haben, dass R-Cu beim Menschen therapeutisch wirksam ist, wenn auch in Bezug auf andere pathologische Situationen26,27.

In den letzten fünfzig Jahren der biogerontologischen Forschung wurden viele Theorien und Ursachen des Alterns entwickelt9,10, aber keine kann die unzähligen Veränderungen, die diesen mehrdimensionalen Prozess begleiten, umfassend erklären. Obwohl wir anerkennen, dass möglicherweise auch andere Faktoren eine Rolle spielen, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass cfChPs globale Auslöser von Alterung und Neurodegeneration sein könnten und dass der therapeutische Einsatz von R-Cu dazu beitragen könnte, gesundes Altern zu einem erreichbaren Ziel zu machen.

Alle für die Interpretation der Ergebnisse relevanten Daten sind im Manuskript enthalten. Rohdaten finden Sie im Figshare-Datensatz-Repository (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20265906).

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Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Snehal Shabrish aufrichtig für die Erstellung der Infografik und Herrn Roshan Shaikh und Herrn Ashish Pawar für ihre Hilfe bei der Erstellung des Manuskripts.

Diese Studie wurde vom Ministerium für Atomenergie der indischen Regierung durch den CTCTMC-Zuschuss für das Tata Memorial Center unterstützt, der an IM vergeben wurde. Die Finanzierungsagentur spielte keine Rolle bei der Forschungsgestaltung, Sammlung, Analyse und Interpretation von Daten und beim Verfassen von Manuskripten.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Kavita Pal und Gorantla V. Raghuram.

Translational Research Laboratory, Tata Memorial Centre, Advanced Center for Treatment, Research and Education in Cancer, Kharghar, Navi Mumbai, 410210, Indien

Kavita Pal, Gorantla V. Raghuram, Jenevieve Dsouza, Sushma Shinde, Vishalkumar Jadhav, Alfina Shaikh, Bhagyeshri Rane, Harshali Tandel, Dipali Kondhalkar, Shahid Chaudhary und Indraneel Mittra

Homi Bhabha National Institute, Anushakti Nagar, Mumbai, 400094, Indien

Kavita Pal, Gorantla V. Raghuram, Jenevieve Dsouza, Sushma Shinde, Vishalkumar Jadhav, Alfina Shaikh, Bhagyeshri Rane, Harshali Tandel, Dipali Kondhalkar, Shahid Chaudhary und Indraneel Mittra

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KP, GVR, JD, SS, VJ, AS, BR, HT, DK und SC führten das Experiment durch. IM, KP und GVR überwachten die Experimente. KP und GVR führten eine Datenanalyse durch. IM konzipierte das Projekt, war für die Gesamtbetreuung verantwortlich und akquirierte die Fördermittel. IM, KP und GVR haben den Artikel geschrieben. IM hat das endgültige Manuskript genehmigt.

Korrespondenz mit Indraneel Mittra.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Pal, K., Raghuram, GV, Dsouza, J. et al. Eine prooxidative Kombination aus Resveratrol und Kupfer reguliert mehrere biologische Merkmale des Alterns und der Neurodegeneration bei Mäusen herunter. Sci Rep 12, 17209 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21388-w

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Eingegangen: 30. Juni 2022

Angenommen: 27. September 2022

Veröffentlicht: 14. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21388-w

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