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Jun 27, 2023

Synthese von Salicylsäurephenylethylester (SAPE) und seine Bedeutung für die immunmodulatorische und krebsbekämpfende Rolle

Wissenschaftliche Berichte Band 12,

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 8735 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Salicylsäurephenylethylester (SAPE) wurde durch Zn(OTf)2-katalysierte selektive Veresterung von Salicylsäure und Phenylethylalkohol synthetisiert und auf seine Rolle als immunmodulatorisches und krebsbekämpfendes Mittel untersucht. Geringe Toxizität und günstige physikalische, Lipinski-artige und Löslichkeitseigenschaften wurden durch ADME-Tox-Studien aufgeklärt. Das molekulare Andocken von SAPE gegen COX-2 ergab im Vergleich zu Ibuprofen und Indomethacin einen günstigeren MolDockscore, Rerank-Score, Interaktionsenergie, interne Pose-Energie und Wasserstoffbrückenbindung. Während der 20-ns-MD-Simulation wurde ein durchschnittlicher RMSD von ~ 0,13 nm für den angedockten Komplex mit stabilem dynamischen Gleichgewichtszustand festgestellt. Eine geringe Bandlücke, die eine starke Bindungsaffinität am aktiven Zentrum des Enzyms vorhersagt, wurde außerdem durch DFT-Analyse vorhergesagt. Der Ester verursachte eine Verringerung des Prozentsatzes der Erythrozytenhämolyse und erwies sich im MTT-Assay als nicht zytotoxisch gegenüber menschlichen Lymphozyten, CaCo-2- und HepG-2-Zellen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass seine In-vitro-Wirksamkeit bei der Hemmung des COX-2-Enzyms sowohl bei LPS-stimulierten Darmzellen als auch bei direkten Sequestrierungstests höher ist als bei Salicylsäure und Indomethacin. Die krebshemmende Wirkung von SAPE wurde an der Brustkrebszelllinie MCF-7 getestet und es zeigte sich eine potenzielle Wirksamkeit im Hinblick auf eine verminderte Lebensfähigkeit der Zellen. Die Analyse der Durchflusszytometrie zeigte den Stillstand des Zellzyklus in den Phasen G1/G0 und S, wobei aufgrund der erhöhten ROS-Produktion eine Induktion der Bildung autophagischer Vesikel und eine Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials beobachtet wurde. Darüber hinaus wurde in diesen Phasen auch der Beginn der Apoptose zusammen mit einer DNA-Schädigung beobachtet. Die Vorbehandlung mit SAPE bei durch Kolitis verursachten Wistar-Ratten zeigte einen niedrigen Krankheitsaktivitätsindex und eine Verringerung des Ausmaßes der Zerstörung des Darmgewebes und der Lipidperoxidation. In den Darmgewebeextrakten der behandelten Gruppen wurde ein deutlicher Anstieg der antioxidativen Enzyme Katalase, GGT und GST sowie ein Rückgang der proinflammatorischen Zytokine IL-6 und TNF-α festgestellt. Die Ergebnisse dieser Studie sind ausreichend glaubwürdig, um zu belegen, dass der synthetisierte Ester (SAPE) als antioxidative und entzündungshemmende Verbindung mit therapeutischem Potenzial für die wirksame Behandlung von Krebs angesehen werden kann.

Phenolester sind teilweise wasserlöslich, weisen antioxidative Eigenschaften auf und kommen reichlich in Naturprodukten vor1. Sie besitzen eine Vielzahl pharmakologischer Aktivitäten wie entzündungshemmende, antioxidative, immunmodulatorische und krebshemmende Wirkungen, z. B. Kaffeesäurephenethylester (CAPE), ein phenolischer Wirkstoff in Propolis von Honigbienen2. Diese Verbindungen sind strukturell unkompliziert; Ihre Synthese ist jedoch in der Regel kompliziert aufgrund der Belastung durch Schutzgruppen für eine verbesserte Chemoselektivität, der Verwendung rauer Bedingungen oder der übermäßigen Verwendung eines der Reaktanten3,4. Die Veresterungsausbeuten hängen mit der elektronischen Verteilung der Phenolsäuren zusammen, die sich auf die Reaktivität der Carboxylfunktion und auch auf die Kohlenstoffkettenlänge der Alkohole auswirkt1. Die Veresterung der Carbonsäurefunktion zeigte im Vergleich zu Standardverbindungen eine höhere entzündungshemmende Wirkung bei verringerter ulzerogener Wirkung5. Darüber hinaus führt die Veresterung von Acetylsalicylsäure, Salicylsäure, Flufenaminsäure, Tolmetin und verschiedenen anderen nichtsteroidalen entzündungshemmenden Säuren zur Produktion von Methylestern mit geringerer ulzerogener Aktivität im Magen6.

Salicylsäure ist eine pharmakologisch wirksame Phenolverbindung und kommt in verschiedenen Pflanzen vor. Seine Wirkungsweise umfasst die Hemmung der Prostaglandinsynthese und die Unterdrückung der Transkription von Genen für Cyclooxygenase7. Es wird über antikardiovaskuläre und krebshemmende Wirkungen von Salicylsäure bei zerebralen Gefäßerkrankungen berichtet8. Acetylsalicylsäure, ein Derivat der Salicylsäure, ist eines der weltweit am häufigsten verwendeten entzündungshemmenden Arzneimittel und induziert eine krebshemmende Wirkung57. Rigas und Kozoni10 synthetisierten ein neues Phenylesterderivat von Aspirin und diese Verbindung hemmte das Wachstum menschlicher Adenokarzinomzellen des Dickdarms (HT-29) durch eine Kombination aus antiproliferativen und proapoptotischen Wirkungen. Çalışkan et al.11 synthetisierten auch eine Reihe neuartiger 1-Benzyl-5(3)-p-tolyl-1H-pyrazol-3(5)-carbonsäure-Derivate und stellten fest, dass einige dieser Verbindungen analgetische und entzündungshemmende Aktivitäten aufwiesen . Kürzlich synthetisierten Liu et al.12 ein neues Derivat durch die Reaktion von Salicylsäure mit α-Aminophosphonat und zeigten, dass das synthetisierte Salicylsäurederivat eine hemmende Wirkung gegen Leber- und Gebärmutterhalskrebszelllinien hatte.

Salicylsäure ist sehr empfindlich gegenüber Oxidation, da ihre Hydroxylierung durch mikrosomale Leberhydroxylasen Gentisinsäure bildet, die durch HO-Angriff weiter reagieren kann, um andere hydroxylierte Derivate zu produzieren. Allerdings besitzen oxidierte Salicylatderivate eine erhöhte antioxidative Aktivität, was teilweise auf ihre Fähigkeit zurückzuführen ist, als Einzelelektronen- oder Wasserstoffatomdonoren zu fungieren13. Diese Phenolderivate weisen eine geringe akute Toxizität auf und die zweite OH-Gruppe in ortho- oder para-Position erhöht die antioxidative Aktivität. Darüber hinaus nimmt die Aktivität von Monophenolen mit einem oder zwei methoxylischen Substituenten erheblich zu14. Die Salicylsäureester verfügen über ein breites Spektrum an biologischen Aktivitäten, und die Veresterung von Salicylsäure mit Methanol wurde unter Verwendung verschiedener Katalysatoren wie Ce4+-modifizierten Kationenaustauschharzen15 und anionenmodifizierten Metalloxiden wie Zirkonoxid, Aluminiumoxid und Siliciumdioxid16 durchgeführt.

Unsere früheren Studien mit Reisbier (einem traditionellen fermentierten Produkt aus Assam, Indien) ergaben das Vorhandensein einer beträchtlichen Menge Salicylsäure in den Starterpflanzen17 und 2-Phenylethanol (PEA) im Endprodukt18. PEA ist ein aromatischer Alkohol, der in fermentierten Lebensmitteln vorkommt und von verschiedenen Hefestämmen aus L-Phenylalanin über den Ehrlich-Weg, an dem drei Enzyme beteiligt sind, hergestellt wird19. Da keine Berichte über die Veresterung von Salicylsäure mit Phenylethylalkohol unter Verwendung von Zinktrifluormethansulfonat [Zn(OTf)2] als Katalysator vorlagen, wurde Salicylsäurephenylethylester (SAPE) erstmals durch Zn(OTf)2-katalysiert synthetisiert selektive Veresterung. Der synthetisierte Ester wurde über In-silico-, In-vitro- und In-vivo-Ansätze weiter auf seine immunmodulatorische Rolle als antioxidatives, entzündungshemmendes und krebsbekämpfendes Mittel getestet.

Die Reaktion zur Herstellung von SAPE ist in Abb. SF1 dargestellt. Die 40:60-Ethylacetat:Hexan-Mischung lieferte hinsichtlich der Verbindungskonzentration die besten Ergebnisse. 13C-NMR- und 1H-NMR-Diagramme des synthetisierten SAPE-Moleküls sind in den Abbildungen dargestellt. SF2 bzw. SF3. Das FTIR-Diagramm des synthetisierten SAPE-Moleküls ist in Abb. SF4 dargestellt. Die erhaltenen Daten sind wie folgt: 13C (ppm): 3409, 65,8, 112,1, 118,1, 119,2, 126,12, 129,0, 130,1, 131,1, 135,2, 138,1, 161,8, 170,1. FTIR (cm−1): 501, 672, 750, 1070, 1110, 1220, 1292, 1480, 1683, 3150. 1H (ppm): 3,1 (t,2H), 4,52 (t,2H), 6,7–6,98 ( m,2H), 7,1–7,48 (m,5H), 7,7–7,8 (m,2H), 10,7 (s,1H).

Die ADME-Toxizitätseigenschaften stehen in direktem Zusammenhang mit der biologischen Wirkung von Arzneimitteln und ihrem Verbleib in einem Organismus, und in silico-Methoden können diese Eigenschaften in einem frühen Stadium des Arzneimitteldesigns vorhergesagt werden20. Löslichkeit, Verteilungsvolumen, Absorption, Transport durch die Blut-Hirn-Schranke, Bioverfügbarkeit, gesundheitliche Auswirkungen und LD50-Werte des SAPE-Moleküls, wie von ACD/Labs I-Lab 2.0 vorhergesagt, sind in Tabelle ST1 dargestellt. Die Löslichkeit (LogSw) betrug −4,03, die Absorption (LogP) 4,15, der Blut-Hirn-Schrankentransport (LogP) 4,15 und das Verteilungsvolumen 0,44 l/kg. Die maximale passive Absorption betrug 100 % auf transzellulärem Weg, während die Permeabilität im menschlichen Jejunum 7,51 × 10–4 cms–1 betrug. Die Wahrscheinlichkeit, dass die Verbindung eine Bioverfügbarkeit von % F (oral) > 30 % aufweist, betrug 0,811 und eine Bioverfügbarkeit von % F (oral) > 70 % betrug 0,358, wohingegen die Wahrscheinlichkeit einer Wirkung auf das Blut 0,39 betrug; Herz-Kreislauf-System 0,5; Magen-Darm-System 0,6, Niere 0,26, Leber 0,14 und Lunge 0,19. Die LD50-Werte für Ratten betrugen 570 mg/kg (intraperitoneal verabreicht) und 2500 mg/kg (oral verabreicht). Die ZNS-Aktivität von SAPE ist auch in Abb. SF5 dargestellt. Die vorhergesagten physikalisch-chemischen Eigenschaften von SAPE, nämlich molare Brechung, molares Volumen, Parachor, Brechungsindex, Oberflächenspannung, Dichte und Polarisierbarkeit sowie massenspektrometriebezogene Eigenschaften von SAPE, sind in Tabelle ST4 aufgeführt. Darüber hinaus wurden auch die Eigenschaften vom Lipinski-Typ abgeleitet und als günstig befunden (Tabelle ST2).

Die Vorhersage der potenziellen Ligandenbindungsstelle (aktives Zentrum) auf COX-2 ergab zunächst ein Hohlraumvolumen von 56,32 Å3, eine Hohlraumoberfläche von 175,36 Å2 und eine Positionierung bei X: 13,44; Y: 24,14; Z: 24,58 mit einem Bindungsstellenradius von 15 Å (Abb. SF6), und eine molekulare Docking-Simulation wurde gegen SAPE, Ibuprofen und Indomethacin durchgeführt. Zur Bewertung der Docking-Lösungen wurde die gitterbasierte Bewertungsfunktion MolDock Score [GRID] verwendet. Da die untersuchten Verbindungen über mehrere interne Freiheitsgrade verfügten, wurde MolDock SE als alternativer Suchalgorithmus21 verwendet. Die Top-Posen, die am aktiven Zentrum von COX-2 angedockt sind, sind in Abb. 1[i] A, B, C, D, E und F dargestellt, und die Werte wurden basierend auf dem Rerank-Score (Tabelle 1) eingestuft.

[i] (A) Protein-Ligand-Wechselwirkungen zwischen SAPE und Resten im aktiven Zentrum des COX-2-Enzyms (B) Bindungsmodus von SAPE an den Resten im aktiven Zentrum des COX-2-Enzyms (C) Protein-Ligand-Wechselwirkungen zwischen Ibuprofen und dem aktiven Zentrum Reste des COX-2-Enzyms (D) Bindungsmodus von Ibuprofen an den Resten des COX-2-Enzyms im aktiven Zentrum (E) Protein-Ligand-Wechselwirkungen zwischen Indomethacin und Resten des COX-2-Enzyms im aktiven Zentrum (F) Bindungsmodus von Indomethacin am Reste im aktiven Zentrum des COX-2-Enzyms. [ii] MD-Simulation, die das RMSD-Diagramm des angedockten Protein-Ligand-Komplexes zeigt und zeigt, dass SAPE-COX-2 stabiler ist als der Ibuprofen- und Indomethacin-Komplex. [iii] (a) Molekülorbital, das das HOMO (E = -6,29 eV) von SAPE darstellt, berechnet auf dem DFT/B3LYP/6-31G-Theorieniveau. (b) Molekülorbital, das das LUMO (E = -1,09 eV) von SAPE darstellt, berechnet auf dem DFT/B3LYP/6-31G-Theorieniveau.

Die molekularen Docking-Scores (Tabelle 1) zeigten, dass SAPE mit den günstigen Docking-Scores an das aktive Zentrum des COX-2-Proteins angedockt werden konnte; Dies ist ein Hinweis darauf, dass das Enzym SAPE im Vergleich zu Ibuprofen und Indomethacin normalerweise bevorzugt. In der molekularen Docking-Engine wurden SAPE, Ibuprofen und Indomethacin basierend auf dem MolDock-Score, dem Rerank-Score und der Interaktionsenergie als die fünf besten Docking-Hits eingestuft. Der in der vorliegenden Untersuchung verwendete MolDock-Score leitet sich von den PLP-Scoring-Funktionen ab, die ursprünglich von Gehlhaar et al.22 vorgeschlagen und später von Yang et al.23 erweitert wurden. Die Docking-Scoring-Funktion Escore ist definiert als: EScore = Einter + Eintra, wobei Einter die Ligand-Protein-Wechselwirkungsenergie und Eintra die innere Energie des Liganden ist. Während der Rerank-Score eine lineare Kombination von E-inter (sterisch, Van-der-Waals-Bindung, Wasserstoffbrückenbindung und elektrostatisch) zwischen dem Liganden und dem Protein und E-intra (Torsion, sp2–sp2, Wasserstoffbrückenbindung, Van-der-Waals-Bindung und) ist elektrostatisch) des Liganden, gewichtet mit den vordefinierten Koeffizienten.

Um die molekulare Wechselwirkung zu untersuchen, wurde die Ligand-Protein-Wechselwirkungsanalyse für die Docking-Hits SAPE, Ibuprofen und Indomethacin mit dem MVD Ligand Energy Inspector ausgewertet. Tabelle 2 zeigt die Details der molekularen Wechselwirkungen der Docking-Hits. Die Ligand-Protein-Wechselwirkung einschließlich der Restwechselwirkung und ihre Wechselwirkungsabstände wurden bestimmt, wobei SAPE molekulare Wechselwirkungen mit Leu353(O) und Tyr356(OH) zeigte (Abb. 1A und B), Ibuprofen mit Arg121(NH2) und Tyr356(OH). (Abb. 1C und D) während Indomethacin mit Arg514(NH) und His90(NE) (Abb. 1E und F). Die Energiekarte und die elektrostatische Wechselwirkung der Andocktreffer sind in den Abbildungen dargestellt. SF7A und B, SF8A und B und Abb. SF9A und B. Die Energiekarte des Enzyms, das zur günstigen sterischen Wechselwirkung (grüne Farbe), zum günstigen Wasserstoffakzeptor (türkise Farbe) und zum günstigen Wasserstoffdonor (gelbe Farbe) sowie zur elektrostatischen Wechselwirkung beiträgt Die angedockten Verbindungen unterstützen zudem die günstige molekulare Wechselwirkung.

Die MD-Simulation wurde nur für den Docking-Hit (angedockte SAPE-COX-2-, Ibuprofen-COX-2- und Indomethacin-COX-2-Komplexe) durchgeführt. RMSD-Daten für die Protein-Liganden-gedockten Komplexe wurden aufgezeichnet und in Abb. 1[ii] dargestellt. Das RMSD-Grundgerüst von 20-ns-MD-Simulationen zum Verständnis der Konformationsänderungen des Protein-Ligand-Bindungskomplexes und des Proteins, die in der dynamischen Umgebung auftreten, wurde ausgearbeitet. Das RMSD-Diagramm erklärt deutlich die Variationen des COX-2-Proteins und der Protein-Ligand-Bindungskomplexe. Der durchschnittliche RMSD betrug ~ 0,13 nm für den angedockten SAPE-COX-2-Komplex. Während das Protein eine durchschnittliche RMSD-Abweichung von ~ 0,23 nm aufwies, zeigte sich ein stabilerer dynamischer Gleichgewichtszustand des Protein-Ligand-Komplexes. Dies bestätigt die Konformationsstabilität des angedockten und des simulierten Komplexes während des 20-ns-Simulationslaufs.

Die HOMO- und LUMO-Energien von SAPE sind in Abb. 1[iii] A bzw. B dargestellt. Diese Energien helfen beim Verständnis der Bandlückenenergie der angedockten Pose. Eine niedrige Bandenergielücke weist auf eine höhere Reaktivität hin und daher wird angenommen, dass die Verbindung stark genug ist, um an das aktive Zentrum des Proteins zu binden. Die Bandlückenenergie (ΔELUMO−HOMO) betrug −5,12 eV, was eine geringe Bandlücke bestätigt und definitiv eine starke Bindungsaffinität am aktiven Zentrum des Zielenzyms aufweist. Die Konturkarte zur Darstellung des elektrostatischen Potenzials von SAPE und das vorhergesagte IR-Spektrum von SAPE wurden ebenfalls auf der theoretischen Ebene DFT/B3LYP/6-31G berechnet und sind in den ergänzenden Abbildungen SF10 bzw. SF11 dargestellt.

Die Ergebnisse des Membranstabilitätstests in Prozent der Hämolyse sind in Abb. 2A dargestellt. Bei der Negativkontrolle PBS betrug sie 0,0704 % und bei der Positivkontrolle Triton X-100 100 %. Im Fall von SAPE hingegen betrug der Wert 58,08 % für 25 µg/ml und unterschied sich bei P ≤ 0,01 deutlich von der Positivkontrolle; und 56,28 % bzw. 54,88 % für 50 µg/ml bzw. 100 µg/ml unterschieden sich ebenfalls signifikant (P ≤ 0,001) von der Positivkontrolle. Daher wurde beobachtet, dass die Oberflächenfunktionalisierung von SAPE den roten Blutkörperchen bis zu 200 µg/ml Stabilität verlieh und Hämolyse in erheblichem Maße verhinderte. Es wurde auch beobachtet, dass die Membranstabilität mit zunehmender SAPE-Konzentration zunahm. Triton X-100 wird im Allgemeinen zur Lyse von Zellen oder zur Permeabilisierung der Membranen lebender Zellen verwendet. Es wurde beobachtet, dass Triton X-100 in Gegenwart von SAPE eine deutlich geringere Hämolyse aufwies als die unberührten Proben.

(A) Membranstabilitätstest von SAPE in Erythrozyten und (B), (C) und (D) Ergebnisse des Zelllebensfähigkeitstests von SAPE nach 48 Stunden an Zellen von (A) PBMC-, (B) Caco2- und (C) HepG2-Zellen mit Dosen von (25, 50 und 100 µg/ml) oder mit 0,1 % DMSO als Vehikelkontrolle, gemessen mit der MTT-basierten Methode. Die Diagramme wurden als Mittelwert ± SEM-Prozentsatz lebender, toter Zellen der drei unabhängigen Sätze dargestellt. Die als Mittelwert ± SEM dargestellten Daten waren im Vergleich zur Kontrolle bei ***P ≤ 0,001, **P ≤ 0,01 und *P ≤ 0,05 signifikant.

Die Ergebnisse für den MTT-Assay von SAPE auf PBMC, menschlichen Darmzelllinien aus Dickdarmkrebs (CaCo-2) und Leberkrebszelllinien (HepG-2) sind in Abb. 2B–D dargestellt. Während bei PBMCs kein signifikanter Unterschied (P ≤ 0,05) in der Zelllebensfähigkeit beobachtet wurde, zeigten die Ergebnisse für den Assay mit CaCo-2-Zellen, dass der Prozentsatz lebensfähiger Zellen mit zunehmender SAPE-Konzentration zunahm. Nach der Behandlung mit 25, 50 und 100 µg/ml SAPE gab es im Vergleich zur Kontrolle keine signifikante Veränderung der Anzahl lebensfähiger Zellen. Bei 200 µg/ml SAPE wurde jedoch ein signifikanter Unterschied (P ≤ 0,05) beobachtet. Da CaCo-2-Zellen mehrere morphologische und funktionelle Merkmale der reifen absorbierenden Enterozyten mit Bürstensaumschicht aufweisen, wie sie im Dünndarm vorkommen24,25, bestätigen die Ergebnisse die Sicherheit der zellulären Aufnahme von SAPE. HepG-2 exprimiert die meisten Arzneimittel-metabolisierenden Enzyme26, und im Test mit HepG-2 wurde beobachtet, dass, obwohl der Prozentsatz lebensfähiger Zellen mit steigenden SAPE-Konzentrationen abnahm, es keine signifikante Veränderung (P ≤ 0,05) gab Anzahl lebensfähiger Zellen nach Behandlung mit unterschiedlichen SAPE-Konzentrationen im Vergleich zur Kontrolle.

COX-2 ist eine induzierbare Isoform der Cyclooxygenase, die hauptsächlich in entzündetem Gewebe produziert wird und in gesundem Gewebe praktisch nicht vorhanden ist. Es wird in wandernden und anderen Zellen durch proinflammatorische Wirkstoffe wie Endotoxine, Mitogene und Zytokine unter pathologischen Bedingungen induziert 27. Viele entzündungshemmende, fiebersenkende, analgetische und antithrombotische Wirkungen werden auf die Hemmung der COX-2-Aktivität durch NSAIDs zurückgeführt. Im LPS-stimulierten CaCo-2-Zellassay wurde die prozentuale Hemmung der COX-2-Produktion berechnet, indem die unbehandelten stimulierten Zellen als Kontrolle betrachtet wurden. Die Ergebnisse sind in Abb. 3A dargestellt. Es wurde beobachtet, dass Phenylethylalkohol allein keine COX-2-hemmende Wirkung besaß. Der Ester zeigte bei allen untersuchten Konzentrationen (25, 50 und 100 µg/ml) eine bessere COX-2-Hemmung als Salicylsäure. Darüber hinaus entsprach seine COX-2-hemmende Wirkung bei diesen Konzentrationen der von Indomethacin. Auch im direkten Hemmungstest wurde beobachtet, dass die Aktivität von SAPE höher war (Abb. 3B). Bei einer Konzentration von 100 µg/ml war die prozentuale relative Hemmung (79,42 %), die durch SAPE erzielt wurde, höher als bei Salicylsäure (68,13 %) und Indomethacin (65,69 %). Darüber hinaus ist der niedrige IC50-Wert von SAPE (9,37 µg/ml) im Vergleich zu Salicylsäure (58,84 µg/ml) und Indomethacin (12,69 µg/ml) ein klarer Hinweis auf die hohe Wirksamkeit des Esters unter In-vitro-Bedingungen.

(A) Die Hemmung der COX-2-Produktion in entzündeten CaCo-2-Zellen und (B) die direkte relative Hemmung von COX-2 durch Phenylethylalkohol (PEA), Salicylsäure (SA), Salicylsäurephenylethylester (SAPE). ) und Indomethacin (IM).

Aus den Ergebnissen geht hervor, dass die Veresterung von Salicylsäure die entzündungshemmende Aktivität von Salicylsäure erheblich erhöht, und diese Ergebnisse bestätigen die vorherigen Ergebnisse5,13,14. Die Ergebnisse sind von enormer Bedeutung, da Verbindungen, die die COX-2-Aktivität hemmen, sowohl bei der Behandlung von Entzündungsreaktionen als auch bei der Aufrechterhaltung der menschlichen Gesundheit und des Wohlbefindens von Bedeutung sind. Dies liegt daran, dass eine fehlerhafte Expression von COX-2 weitgehend mit der Pathogenese vieler Krebsarten wie Darmkrebs in Verbindung gebracht wird und seine hohen Konzentrationen mit einer verringerten Überlebensrate von Krebspatienten in Verbindung gebracht werden28.

Um die zytotoxische Wirkung von SAPE auf MCF-7-Zellen zu bestimmen, wurde ein Zelllebensfähigkeitstest unter Verwendung der Methoden MTT (Abb. 4a) und Trypanblau-Farbstoffausschluss (Abb. 4b) durchgeführt. Zellen, die mit verschiedenen Dosen (25, 50 und 100 µg/ml) SAPE behandelt wurden, wurden auf ihre Wirkung auf die Anzahl lebender und toter Zellen untersucht, die am Ende von 48 Stunden berechnet wurden. Es wurde beobachtet, dass die Abnahme der Gesamtzellzahl mit einem Anstieg des signifikanten Zelltods einhergeht. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass SAPE die exponentiell wachsende Lebensfähigkeit von MCF-7-Zellen mit zunehmender Konzentration erheblich hemmen konnte, während es gleichzeitig keine ausgeprägte Wirkung auf normale Zellen hatte, wie aus der Studie mit menschlichen PBMCs, Caco2- und HepG2-Zellen hervorgeht , was darauf hindeutet, dass die Wirkung von SAPE selektiv für Krebszellen war.

(a) Ergebnisse des Zelllebensfähigkeitstests von SAPE an MCF-7-Zellen, gemessen mit der MTT-basierten Methode. (b) Zelllebensfähigkeitstest von SAPE nach 48 Stunden an MCF-7-Zellen mit Dosen von (25, 50 und 100 µg/ml) oder mit 0,1 % DMSO als Vehikelkontrolle unter Verwendung der Trypanblau-Ausschlussmethode. Die Diagramme werden als Mittelwert ± SEM-Prozentsatz lebender und toter Zellen der drei unabhängigen Sätze dargestellt. Die Werte waren bei *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 und ***P ≤ 0,001 im Vergleich zur Kontrolle signifikant.

Die MCF-7-Zelllinie ist ein ER-positives menschliches Brustkarzinom mit luminalem Subtyp29. Es zeigte sich, dass die Behandlung von MCF-7-Zellen mit SAPE tendenziell zu einer Veränderung der Verteilung verschiedener Zellzyklusphasen führt. Wie aus Abb. 5A hervorgeht, führte die Behandlung mit SAPE zu einer Verringerung des Prozentsatzes der Zellen in der G0/G1- und S-Phase im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Dies weist darauf hin, dass SAPE zur Induktion von Apoptose führt, da es sich bei den Sub-G1-Zellen tatsächlich um apoptotische Zellen mit niedrigem DNA-Gehalt handelt. Sowohl in der G2/M- als auch in der apoptopischen Phase zeigte sich, dass die Behandlung mit SAPE zu einem signifikanten Anstieg des Zellanteils führt. Somit induziert SAPE dosisabhängig einen deutlichen G2/M-Stillstand in MCF-7-Zellen (P ≤ 0,001). Als jedoch die SAPE-Dosis auf bis zu 100 µg/ml erhöht wurde, stellten wir einen signifikanten Rückgang des Prozentsatzes der Zellen in der G1-Phase fest, nichtsdestotrotz wurden mehr Zellen auch in der S-Phase sowie in der apoptotischen Phase angehalten ( Abb. 5A) des Zellzyklus. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hemmung des Zellwachstums zu einem Anstieg der Anzahl von Zellen führt, die in die G1-Phase eintreten, was anschließend die Zellapoptose induziert.

(A) Zellzyklusanalyse von SAPE auf MCF-7-Zellen mit Dosen von 25, 50, 100 µg/ml oder mit 0,1 % DMSO als Vehikelkontrolle für 48 Stunden Zellzyklusphasenverteilung, erfasst in einem Durchflusszytometer. Histogrammanzeige des DNA-Gehalts, d. h. PI-Fluoreszenz (x-Achse) vs. Anzahl (y-Achse) und entsprechendes Balkendiagramm ist die Darstellung der Zellzyklus-Phasenverteilung der G0/G1-, S- und G2/M-Phasen. (B) Die Wirkung von SAPE auf die intrazellulären ROS-Spiegel in MCF-7-Zellen nach 48 Stunden wurde mit einem Durchflusszytometer mit ROS-spezifischem Fluoreszenzfarbstoff (DCFDA) analysiert. Die intrazellulären ROS-Werte wurden durch ein Histogramm dargestellt und die entsprechenden durch ein Balkendiagramm dargestellten Faltungsänderungen wurden durch Durchflusszytometrie bewertet. (C) Wirkung von SAPE auf MMP in MCF-7-Zellen. Danach wurde die Fluoreszenzintensität von Rhodamin-123 mittels Durchflusszytometrie bei 488 nm (Anregung) und 525–530 nm (Emission) gemessen und die Daten durch ein Histogramm und entsprechende Faltungsänderungen dargestellt, die durch ein Balkendiagramm dargestellt wurden. Die als Mittelwert ± SEM dargestellten Daten waren im Vergleich zur Kontrolle bei ***P ≤ 0,001, **P ≤ 0,01 und *P ≤ 0,05 signifikant.

Der ROS-Spiegel in den Zellen wurde analysiert, um die Rolle von ROS bei der SAPE-induzierten Apoptose zu untersuchen. Es wurde beobachtet, dass am Ende der 48-stündigen SAPE-Exposition die ROS-Erzeugung in signifikanter Weise induziert wurde, was durch die Zunahme der Fluoreszenzintensität belegt wurde (Abb. 5B). Im Vergleich zu unbehandelten Zellen stellten wir fest, dass SAPE einen Anstieg der Anzahl ROS-positiver Zellen sowie der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) auf das 1,30-fache (P ≤ 0,001) für MCF-7 verursachte, wie in Abb. 5B gezeigt. ROS werden hauptsächlich in den Mitochondrien produziert und ein Anstieg des ROS-Spiegels könnte mitochondrial ausgelöste Ereignisse auslösen, die zur Apoptose führen. Außerdem könnte die Produktion von ROS die Homöostase des Enzymsystems der Antioxidantien stören, die für das Abfangen von ROS verantwortlich sind. Es gibt Hinweise darauf, dass die ROS-Akkumulation auf einen Anstieg des Verhältnisses von Bax und Bcl-2 zurückzuführen sein könnte, was den MMP verringert (wie im Abschnitt „MMP-Analyse“ deutlich wird) und die Freisetzung von Cytochrom C58 weiter induziert. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass SAPE den ROS-Spiegel in MCF-7-Zellen deutlich erhöhen kann und ein Hinweis auf eine mögliche Funktion von ROS im Apoptoseprozess ist.

Der MMP-Verlust wurde analysiert, da ein Verlust von Δψm direkt mit einer Störung des Gleichgewichts zwischen der Expression von pro- und anti-apoptotischen Proteinen innerhalb der Bcl-2-Familie zusammenhängt. Eine Verringerung von Δψm führt zur Freisetzung von mitochondrialem Cytochrom C, was zur Bildung von Apoptosomen führt, was letztendlich zu einer durch Mitochondrien vermittelten Apoptose führt30. Der Verlust von ΔΨm spiegelte sich in einer Abnahme der Intensität der Rhodamin-123-Fluoreszenzfärbetechnik wider, die zum Nachweis der Integrität der Mitochondrienmembran oder der Depolarisation der Mitochondrienmembran verwendet wurde. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung zeigten, dass es bei der SAPE-Exposition im Vergleich zur Kontrolle zu einer signifikanten Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials kam. Dies wurde anhand der Änderung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) belegt, die bei höchsten SAPE-Dosen nach 48 Stunden einen Anstieg der Änderung um das 1,34-fache (P ≤ 0,001) zeigte (Abb. 5C). Diese Ergebnisse haben eindeutig gezeigt, dass SAPE Apoptose über mitochondriale Wege induzieren könnte, und dies könnte eine neuartige Strategie für die Krebstherapie sein, da Mitochondrien einer der Hauptwege für Apoptose sind.

Apoptose oder programmierter Zelltod vom Typ I ist ein körpereigener Mechanismus zur Zerstörung von Zellen, die eine Bedrohung für die physiologische Integrität eines Organismus darstellen. Es wird durch das Ungleichgewicht zwischen proapoptotischen und antiapoptotischen Signalen aktiviert31. Die wichtigste morphologische Veränderung, die die Apoptose charakterisiert, ist die Bildung apoptotischer Körper, verbunden mit Membranbläschen, Zellschrumpfung und Chromatinkondensation30. Die Ergebnisse (Abb. 6A) zeigten, dass MCF-7-Zellen, die mit SAPE in verschiedenen Dosen behandelt wurden, einen Farbverschiebungsgradienten von Grün-Orange-Rot aufwiesen, wenn sie mit der dualen AO/EtBr-Färbung gefärbt wurden, was den Effekt der wirksamen Konzentration anzeigt, der die Zellen ausgesetzt waren mit, während unbehandelte Krebszellen weiterhin grün fluoreszierten. Somit könnte interpretiert werden, dass eine signifikante Erhöhung der SAPE-Konzentration (25 und 100 g/ml) (P ≤ 0,001) eine Schädigung der Krebszellen hervorrief und die Apoptose der Zellen förderte. Dieser Kernschaden reicht von früher Apoptose (bei niedrigen Dosen) bis zu später Apoptose oder Nekrose bei steigender Dosis (Abb. 6A). Somit könnte die Induktion von Apoptose in MCF-7-Zellen, die sie anfälliger für die Phagozytose des Wirts macht, ohne eine Entzündung auszulösen, auf die tumorizide Aktivität von SAPE zurückgeführt werden.

(A) Repräsentative Bilder des Apoptosetests von SAPE auf MCF-7 mit unterschiedlichen Dosen (25 und 100 µg/ml) oder mit 0,1 % DMSO als Vehikelkontrolle für 48 Stunden, bestimmt durch AO/EtBr-Farbstofffärbung; (B) Repräsentative Kometenbilder für DNA-Schäden in SAPE in MCF-7-Zellen, die durch einen neutralen Kometentest nachgewiesen wurden, und Quantifizierung des Prozentsatzes DNA-geschädigter Zellen durch Messung der (i) Fläche des Kometen und (ii) der Länge des Kometenschweifs mit Öffnen Sie die Comet-Software. Daten dargestellt als Mittelwert ± SEM. Die Werte waren bei *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 und ***P ≤ 0,001 im Vergleich zur Kontrolle signifikant.

Der Zugriff auf die Integrität der DNA ist ein nützlicher Marker für das Screening potenzieller Antikrebsmittel, da das Phänomen der Apoptose von Zellen nach einer DNA-Schädigung zum Ausdruck kommt31. Darüber hinaus könnte die Induktion von DNA-Schäden ein wirksames Instrument zur Krebsbehandlung sein. Die in Abb. 6B dargestellten Ergebnisse des Neutral-Comet-Assays zeigten, dass die DNA-Schädigung in MCF-7-Zellen, die 48 Stunden lang drei verschiedenen Konzentrationen von 25 und 100 µg/ml SAPE ausgesetzt waren, signifikant (P ≤ 0,001) für die jeweiligen Zellen genotoxisch war erkennbar an der konzentrationsabhängigen Zunahme der DNA-Fragmentierung. Der Comet-Assay ist ein Hinweis auf das Ausmaß der heterogenen DNA-Schädigung innerhalb der einzelnen Zellen, und die DNA-Schädigung in MCF-7-Zellen zeigt darüber hinaus einen potenziellen Tumorreaktionsfaktor für die Verbindung32. Basierend auf diesen Beobachtungen fanden wir heraus, dass SAPE die Apoptose von MCF-7-Zellen induzieren kann. Antikrebsmittel, die die Apoptose modulieren könnten, können den Steady-State von Zellpopulationen beeinflussen, was für die Behandlung und Therapie von Krebs wirksam ist. Daher könnte spekuliert werden, dass SAPE über die Induktion von Apoptose eine krebshemmende Wirkung gegen MCF-7-Zellen aufweist.

Autophagie oder programmierter Zelltod vom Typ II ist ein evolutionär konservierter katabolischer Mechanismus des Zelltods, der den Abbau beschädigter Proteine ​​oder Organellen beinhaltet. Es übt eine Schutzfunktion aus, die es Krebszellen ermöglicht, gegen zytotoxische Wirkstoffe zu überleben. Während der Autophagie binden Autophagosomen zytoplasmatische Bestandteile und verschmelzen anschließend mit Lysosomen, um Autolysosomen zu bilden, in denen die eingeschlossenen Organellen abgebaut werden29,30. Um festzustellen, ob die Hemmung der Autophagie die SAPE-induzierte Apoptose in MCF-7-Zellen verstärkt, wurde die Autophagieanalyse durchgeführt. Es wurde beobachtet, dass die SAPE-Exposition gegenüber MCF-7-Zellen einen signifikanten Anstieg sowohl des autophagischen Körpers als auch der Säurebläschen verursacht. Wir haben auch die Wirkung der SAPE-Behandlung auf die Bildung saurer vesikulärer Organellen (AVOs) in MCF-7-Zellen für 48 Stunden mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie nach Anfärbung mit dem lysosomotropen Mittel AO sichtbar gemacht, wie in Abb. 7A gezeigt. Es ist offensichtlich, dass die Behandlung von MCF7-Zellen mit SAPE zur Bildung von Vakuolen und kondensierten Mitochondrien, dispergiertem Chromatin, Bildung apoptotischer Körper, autophagischen Vesikeln und Membranbläschen führte. Durch Fluoreszenzstudien erhaltene Bilder wurden mit ImageJ verarbeitet, um den Säuregrad sowie die Anzahl der Autophagosomen zu bewerten. Während unbehandelte Zellen eine normale Kern- und Zytoplasmamorphologie aufwiesen, wurde beobachtet, dass der Säuregehalt der Zellen bei höheren Konzentrationen deutlich zunahm (Abb. 7B). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Anzahl der Autophagosomen bei der Behandlung zunimmt, was möglicherweise auf einen Anstieg des Säuregehalts zurückzuführen ist, und dies spiegelt weiter die autophagische Mikroumgebung innerhalb der Zellen wider.

(A) Fluoreszenzmikroskopie zur Analyse von sauren Vesikeln und Autophagosomen gegen mit SAPE behandelte MCF-7-Zellen. (B) Analyse des Säuregrads gegen mit SAPE (25, 50, 100 µg/ml) behandelte MCF7-Zellen für 48 Stunden. (C) Analyse der autophagischen Vesikelbildung gegen MCF7-Zellen, die 48 Stunden lang mit SAPE (25, 50, 100 µg/ml) behandelt wurden; (D) Die mittlere Fluoreszenzintensität von AO, gemessen mittels Durchflusszytometrie bei 488 nm (Anregung) und 525–530 nm (Emission). Daten ausgedrückt als (Mittelwert ± SEM, n = 3). Die Werte waren bei *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 und ***P ≤ 0,001 im Vergleich zur Kontrolle signifikant.

Für die quantitative Analyse haben wir die AO-Fluoreszenz mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Die Bildung autophagischer Vakuolen wurde durch eine erhöhte Intensität der roten Fluoreszenz nachgewiesen (Abb. 7C). Es wurde beobachtet, dass am Ende der 48-stündigen Exposition durch SAPE-Behandlung autophagische Vakuolen signifikant induziert wurden, was durch die Zunahme der Fluoreszenzintensität angezeigt wurde (Abb. 7D). Im Vergleich zu unbehandelten Zellen stellten wir fest, dass mit SAPE behandelte Zellen in einem Dosierungsbereich von 25–100 µg/ml einen erhöhten MFi von autophagischen Vakuolen (1,48-fach bei 50 µg/ml) in positiven Zellen verursachten, bei 100 µg/ml jedoch einen MFi-Abfall verursachten 0,613-fach wie bei 48 h. Wie aus anderen Studien29,30 hervorgeht, spielt Autophagie eine Rolle bei der Regulierung der Überlebensreaktionen in malignen Melanomzellen, die mit verschiedenen immuntherapeutischen Ansätzen bekämpft wurden, und somit belegen diese Ergebnisse eine positive Rolle von SAPE als Antikrebsmittel gegen MCF-7-Zellen.

Die für den Test des akuten Entzündungsprozesses anhand des Pfotenödemmodells erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. In der mit SAPE behandelten Gruppe wurde von der 1. bis zur 5. Stunde ein Rückgang des Prozentsatzes an Pfotenödemen beobachtet. Ein signifikanter Unterschied wurde jedoch nur in der 3., 4. und 5. Stunde nach der Carrageenan-Injektion beobachtet. Dieser Unterschied nach der 3. Stunde könnte ein Hinweis auf die Wirkung von SAPE sein, die die Hemmung der Synthese oder Freisetzung von Prostaglandinen beinhaltet. Das Fehlen eines signifikanten Unterschieds in den frühen Morgenstunden könnte auf den fehlenden Einfluss von SAPE auf die frühen Mediatoren Histamin, Serotonin oder Bradykinin zurückzuführen sein. Diese frühen Mediatoren werden zunächst in der ersten Stunde nach der Carrageen-Injektion freigesetzt, gefolgt von der Freisetzung von Prostaglandinen etwa in der dritten Stunde. Die Ergebnisse deuten daher darauf hin, dass SAPE als Inhibitor der Cyclooxygenase-Enzyme wirken könnte, die an der Prostaglandinsynthese beteiligt sind33.

Die Anfangsgewichte der Ratten sind in Tabelle ST3 aufgeführt. Nach der Behandlung mit nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneimitteln kann es bei Tieren zu Gewichtsverlust kommen. Dieser Gewichtsverlust kann hauptsächlich auf Kachexie zurückzuführen sein, deren Hauptursache ein Zytokinüberschuss sein könnte34. Wie in Abb. SF12 zu sehen ist, wurde jedoch in allen drei Gruppen ein stetiger Anstieg des Körpergewichts im Laufe der Zeit beobachtet. Der Anstieg war jedoch in der Kontrollgruppe höher als in den mit SAPE behandelten und mit Indomethacin behandelten Gruppen. Entzündliche Darmerkrankungen (IBDs) wie Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC) werden mithilfe des Krankheitsaktivitätsindex (DAI) gekennzeichnet, der dabei hilft, die Krankheitsaktivität zu einem bestimmten Zeitpunkt zu bewerten35. Die DAI-Bewertungskriterien und die DAI-Bewertungen der verschiedenen Behandlungsgruppen von Ratten sind in den Tabellen ST4 bzw. Tabelle ST5 aufgeführt. Es zeigte sich, dass die Kolitis-induzierte Gruppe ohne jegliche Behandlung (RG-CI) mit 2,42 den höchsten DAI-Wert aufwies, während er in der Kontrollgruppe 0 betrug. Sowohl die mit SAPE (1,04 DAI) als auch die mit Indomethacin (0,92 DAI) behandelte Gruppe verzeichnete Werte niedrigere Werte als die RG-CI-Gruppe. Daher gab es einen deutlichen Unterschied im Ausmaß der induzierten Erkrankung, nachdem die Rattenmodelle einer Vorbehandlung mit SAPE unterzogen wurden.

Die herausgeschnittenen Därme der verschiedenen Gruppen von Ratten nach der Behandlung und Euthanasie sowie ihre SEM-Bilder sind in Abb. 8 dargestellt. Ein gewisses Maß an Gewebeschädigung und -ruptur wurde in den Kolitis-induzierten Gruppen (RG-CI, RG-SP und RG-IM) beobachtet ), was in der Kontrollgruppe nicht beobachtet wurde. Im Vergleich zur Kolitis-induzierten Gruppe ohne Behandlung zeigten die REM-Bilder der mit SAPE und Indomethacin behandelten Gruppen eine deutliche Verringerung des Ausmaßes der Gewebeschädigung. Dies deutet eindeutig auf eine deutliche Verringerung des Kolitisausmaßes nach der Behandlung mit SAPE hin.

Ausgeschnittene Därme und SEM-Bilder des Darmabschnitts von (A) RG-CF-Ratten (Kolitis-freie Kontrollgruppe ohne Behandlung), (B) RG-CI-Ratten (Kolitis-induzierte Gruppe ohne Behandlung), (C) RG-SP ( Kolitis-induzierte Gruppe, behandelt mit SAPE) Ratten, RG-IM (Kolitis-induzierte Gruppe, behandelt mit Indomethacin) Ratten.

Entzündungsbedingte oxidative Schäden werden durch die Abnahme der Aktivitäten antioxidativer Enzyme wie Katalase (CAT), Glutathion-S-Transferase (GST) und Gamma-Glutamyltransferase (GGT) verschlimmert, die bei Bedingungen, die mit oxidativem Stress einhergehen, als Fänger freier Radikale fungieren36. Die mehrfach ungesättigten Fettsäuren, Glykolipide, Phospholipide und Cholesterin sind bekannte Ziele der peroxidativen Modifikation37 und die häufigsten Ziele sind Bestandteile biologischer Membranen38. Bei der Lipidperoxidation entstehen zahlreiche sekundäre Oxidationsprodukte wie Aldehyde, von denen Malondialdehyd (MDA) das mutagenste ist37. MDA ist ein Aldehyd mit niedrigem Molekulargewicht, der als Endprodukt durch Zersetzung von Arachidonsäure und größeren PUFAs durch enzymatische oder nicht-enzymatische Prozesse entsteht. Eine übermäßige MDA-Produktion wurde mit verschiedenen pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht, und bei Personen, die an mehreren Krankheiten leiden, ist der MDA-Spiegel erhöht. Daher wird es aufgrund seiner einfachen Reaktion mit Thiobarbitursäure (TBA) als praktischer Biomarker für die Lipidperoxidation verwendet37,38. Die Ergebnisse der Untersuchung des MDA-Gehalts im Darmgewebeextrakt für verschiedene Behandlungsgruppen von Ratten sind in Abb. 9a dargestellt. Es zeigte sich, dass zwischen allen Gruppen ein signifikanter Unterschied (P ≤ 0,05) im MDA-Gehalt bestand. Die Kolitis-induzierte Gruppe ohne Behandlung wies den höchsten Gehalt auf (0,26 pg/µl), während der Gehalt in der mit SAPE behandelten Gruppe (0,10 pg/µl) geringer war als in der mit Indomethacin behandelten Gruppe (0,16 pg/µl). Daher könnte SAPE als wirksamer Inhibitor der Lipidperoxidation in entzündetem Gewebe angesehen werden. CAT gilt als empfindlicher Biomarker für oxidativen Stress in Zellen, da es eine primäre Komponente der antioxidativen Abwehr darstellt, um Zellen vor oxidativem Stress zu schützen, indem es toxisches Wasserstoffperoxid aus der intrazellulären und extrazellulären Umgebung eliminiert36,39. Die Ergebnisse der Untersuchung der Katalase (CAT)-Konzentration im Darmgewebeextrakt für verschiedene Behandlungsgruppen von Ratten sind in Abb. 9b dargestellt. Es zeigte sich, dass zwischen allen Gruppen ein signifikanter Unterschied (P ≤ 0,05) im CAT-Gehalt bestand. Die Kolitis-induzierte Gruppe ohne Behandlung wies den niedrigsten Gehalt auf (35,25 mU/ml), während die Kontrollgruppe den höchsten Gehalt aufwies (201,25 mU/ml). Der Gehalt war in der mit SAPE behandelten Gruppe erneut höher (168,75 mU/ml) als in der mit Indomethacin behandelten Gruppe (152,00 mU/ml), was auf eine positive Rolle von SAPE bei der Synthese und Aktivität des antioxidativen Enzyms CAT hinweist.

(a) Malondialdehyd (MDA)-Gehalt; (b) Katalase (CAT)-Gehalt; (c) γ-Glutamyltransferase (GGT)-Aktivität; (d) Glutathion-S-Transferase (GST)-Aktivität; (e) Gehalt an Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-α) und (f) Gehalt an Interleukin 6 (IL-6) im Darmgewebeextrakt für verschiedene Behandlungsgruppen von Ratten (RG-CI: Kolitis-induzierte Gruppe ohne Behandlung; RG- CF: Kolitis-freie Kontrollgruppe ohne jegliche Behandlung; RG-SP: Kolitis-induzierte Gruppe, behandelt mit SAPE; Gruppe RG-IM: Kolitis-induzierte Gruppe, behandelt mit Indomethacin).

GGT trägt zum extrazellulären Katabolismus von Glutathion (GSH) bei, da es die Übertragung der Gamma-Glutamyl-Einheit von konjugiertem GSH auf Akzeptoren wie Aminosäuren und Dipeptide katalysiert. Es zerlegt GSH auch in seine konstitutiven Aminosäuren und sorgt so für die geschwindigkeitsbestimmende Aminosäure-Cystein-De-novo-Synthese von GSH40. Der GGT-Spiegel im Serum wird durch verschiedene Faktoren bestimmt, wie z. B. Entzündungen, alkoholische Lebererkrankungen, Erkrankungen der Gallenblase und der Gallenwege, Plasmalipid-/Lipoproteingehalt, Bluthochdruck, Hyperurikämie, Diabetes und verschiedene Medikamente40,41. Die Ergebnisse der Untersuchung der GGT-Aktivität im Darmgewebeextrakt für verschiedene Behandlungsgruppen von Ratten sind in Abb. 9c dargestellt. Es zeigte sich, dass zwischen allen Gruppen ein signifikanter Unterschied (P ≤ 0,05) im GGT-Gehalt bestand. Die Kolitis-induzierte Gruppe ohne Behandlung verzeichnete den höchsten Gehalt (13,32 nmol/Einheit/ml). Der Gehalt sowohl in der mit SAPE behandelten Gruppe (5,21 nmol/Einheit/ml) als auch in der mit Indomethacin behandelten Gruppe (6,39 nmol/Einheit/ml) war höher als in der Kontrollgruppe (2,16 nmol/Einheit/ml). Alternativ sind die GSTs wichtige Phase-II-Entgiftungsenzyme, die die Konjugation elektrophiler Substrate an GSH katalysieren und auch andere Funktionen wie Peroxidase- und Isomeraseaktivitäten, den Schutz von Zellen vor H2O2-induziertem Zelltod und die nichtkatalytische Bindung endogener und exogener Liganden haben . Sie führen zur Bildung von GSH-Konjugaten, die schließlich durch verschiedene Transportmechanismen, unter anderem durch die ATP-abhängige GS-X-Pumpe, eliminiert werden42,43. Die Ergebnisse des Assays zur GST-Aktivität im Darmgewebeextrakt für verschiedene Behandlungsgruppen von Ratten sind in Abb. 9d dargestellt. In allen Gruppen wurde ein signifikanter Unterschied (P ≤ 0,05) in der GST-Aktivität beobachtet. Die Kontrollgruppe verzeichnete die niedrigste Aktivität (0,17 µmol/ml/min), während die Kolitis-induzierte Gruppe ohne Behandlung die höchste Aktivität aufwies (0,29 µmol/ml/min). Die Aktivität war jedoch in der mit SAPE behandelten Gruppe höher (0,26 µmol/ml/min) als in der mit Indomethacin behandelten Gruppe (0,24 µmol/ml/min). Die GGT- und GST-Induktion in Zellen erfolgt als schützende Anpassung gegen Oxidationsmittel, die während des normalen Stoffwechsels produziert werden oder wenn oxidativer Stress aufgrund eines Faktors wie der Anwesenheit von ROS44 zunimmt, und die erhaltenen Ergebnisse deuten auf eine Verringerung des oxidativen Stressniveaus hin Anwendung von SAPE im erkrankten Zustand.

Die Zytokine stimulieren die Produktion von Akute-Phase-Proteinen, die bei Entzündungsprozessen entstehen. Zu diesen entzündungsassoziierten Zytokinen gehören Interleukin-6 (IL-6), IL-1β, Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Interferon-γ, transformierender Wachstumsfaktor-β, IL-8, koloniestimulierende Faktoren und Wachstumsfaktoren . Funktionelle Pleiotropie und Redundanz sind charakteristische Merkmale dieser Zytokine45,46. TNF-α ist ein proinflammatorisches Zytokin, das an der angeborenen Immunantwort beteiligt ist47. Makrophagen sind die Hauptproduzenten von TNFα und regulieren auf zellulärer Ebene eine Reihe wichtiger Zellfunktionen, darunter Zellüberleben, Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose, die durch die beiden Transmembranrezeptoren TNF-R1 und TNF-R2 vermittelt werden. Im Allgemeinen führt TNFα nicht zum Abtöten von Zellen, sondern fördert die Gentranskription und Zellaktivierung9,48. Im Krankheitszustand regulieren die TNFα-Produktion und die TNF-Rezeptor-Signalisierung viele Aspekte der Makrophagenfunktion. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Steuerung der Produktion einer proinflammatorischen Zytokinkaskade bei vielen entzündlichen Erkrankungen wie Morbus Crohn, rheumatoider Arthritis, Arteriosklerose, Sepsis, Psoriasis, Diabetes und Fettleibigkeit. Es ist einer der am häufigsten vorkommenden frühen Mediatoren in entzündetem Gewebe, da es nach Trauma, Infektion oder Kontakt mit bakteriellem LPS48 schnell freigesetzt wird. Die Ergebnisse der Untersuchung des TNF-α-Gehalts im Darmgewebeextrakt für verschiedene Behandlungsgruppen von Ratten sind in Abb. 9e dargestellt. Der TNF-α-Gehalt war in der Kontrollgruppe am niedrigsten (7,65 pg/ml). Der TNF-α-Gehalt war sowohl in der mit SAPE (14,66 pg/ml) als auch mit Indomethacin (13,75 pg/ml) behandelten Gruppe niedriger als in der Kolitis-induzierten Gruppe ohne Behandlung (22,28 pg/ml).

IL-6 ist ein pleiotropes Zytokin, das an der Entzündungsstelle produziert wird und eine Schlüsselrolle bei der Akute-Phase-Reaktion, der Regulierung von Immunantworten und der Hämatopoese spielt49. Es ist auch an der Regulierung metabolischer, regenerativer und neuronaler Prozesse beteiligt. Akute Phasenänderungen spiegeln das Vorhandensein und die Intensität einer Entzündung wider und IL-6 ist der Hauptstimulator für die Produktion der meisten Akute-Phase-Proteine45. IL-6 kann von einer Vielzahl von Zellen nach einer Stimulation wie einer Infektion, einem Trauma oder einer immunologischen Herausforderung produziert werden. Es wurde auch festgestellt, dass es eine schützende Rolle im Modell des septischen LPS-Galactosamin-Schocks bei Mäusen spielt49. Die Ergebnisse der Untersuchung des IL-6-Gehalts im Darmgewebeextrakt für verschiedene Behandlungsgruppen von Ratten sind in Abb. 9f dargestellt. Sein Gehalt war in der Kontrollgruppe am niedrigsten (26,91 pg/ml). Es gab keinen signifikanten Unterschied im Gehalt zwischen den mit SAPE (90,76 pg/ml) und Indomethacin (82,83 pg/ml) behandelten Gruppen, und beide wiesen einen viel geringeren Gehalt auf als die Gruppe, die durch Kolitis ohne Behandlung behandelt wurde (109,56 pg/ml). Die Ergebnisse sowohl des IL6- als auch des TNF-α-Tests zeigten eindeutig einen Rückgang des Entzündungsgrads nach der Behandlung mit SAPE.

Die Zn(OTf)2-katalysierte selektive Veresterung wurde erfolgreich zur Herstellung von Salicylsäurephenylethylester (SAPE) eingesetzt. Dieser Ester erwies sich als nicht zytotoxisch, hatte vielversprechende entzündungshemmende und antioxidative Wirkungen und die Ergebnisse entsprachen denen etablierter NSAID-Wirkstoffe. Der Ester zeigte Antikrebsaktivität gegen MCF7-Brustkrebszellen durch Stillstand des Sub-G1-Zellzyklus, MMP-Reduktion, ROS-Akkumulation und Induktion von Apoptose und Autophagie. Die Ergebnisse geben erstmals einen Einblick in die Verwendung dieses speziellen Esters als potenzielles entzündungshemmendes und krebstherapeutisches Mittel. Weitere Untersuchungen zur Aufklärung der zellulären Aufnahme und des Metabolismus von SAPE würden dazu beitragen, diesen Ester als NSAID zu bestätigen.

Eine menschliche Blutprobe zur Gewinnung primärer mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) wurde freiwillig im Gesundheitszentrum der Tezpur-Universität, Assam, Indien, entnommen. Die embryonale menschliche Leberkrebszelllinie (HepG2), die epitheliale kolorektale Adenokarzinomzelllinie (CaCo-2) und die epitheliale Brustkrebszelllinie (MCF-7) wurden vom National Center for Cell Science (NCCS), Pune, Indien, bezogen. Die Medien für die Tierzellkultur wurden von HiMedia, Indien, gekauft und die Chemikalien und Lösungsmittel wurden von Sigma Aldrich, USA und Merck, Deutschland, bezogen.

Salicylsäure (1,0 Äquiv.) wurde unter N2-Atmosphäre zu einer gerührten Lösung von I2 (2,0 Äquiv.) und Triphenylphosphin (2,0 Äquiv.) in trockenem Acetonitril (10 ml) gegeben und die Reaktionsmischung 10 Minuten lang gevortext, dann wurde Zn(OTf) 2 (5 Mol-%) wurde zugegeben. Das Rühren wurde 30 Minuten lang bei 60 °C fortgesetzt und dann Phenylethylalkohol (1,1 Äquiv.) in trockenem Acetonitril zugegeben. Nach Abschluss der Reaktion (überwacht durch DC) wurde die Mischung auf 30 °C abgekühlt und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und mit gesättigter NaHCO3 und anschließend Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet und unter Vakuum konzentriert. Säulenchromatographie mit Kieselgel und einem Gradientenlösungsmittelsystem von Ethylacetat zu Hexan ergab die Zielverbindung50 und wurde wie im Abschnitt „NMR- und FTIR-Studie zur Strukturvalidierung von SAPE“ erwähnt validiert.

Die 13C- und 1H-NMR-Studien wurden in einem NMR-Spektrophotometer (ECS-400, JEOL, Japan) durchgeführt und die für die Datenerfassung verwendete Software war Delta, Ver. 4.3.6. Die Testverbindungen wurden in Chloroform in NMR-Qualität gelöst und die Feldstärke wurde auf 9,389766 [T] (400 MHz) eingestellt. Die FTIR-Messwerte wurden in einem FTIR-Spektrophotometer (Spectrum 100, Perkin Elmer, USA) aufgenommen. Die Daten wurden im Absorptionsmodus (A) gesammelt und der ausgewählte Wellenlängenbereich betrug 4000 bis 400 cm−1. Die Auflösung und die Anzahl der Scans pro Probe betrugen 4 cm−1 bzw. 4.

Für die molekulare Docking-Simulation wurde die Struktur von SAPE, Indomethacin und Ibrupofen mit ChemOffice 2010 (Cambridge Soft, Massachusetts, USA) generiert. Die Verbindungen wurden dann für Docking-Simulationen in ein 3D-Format konvertiert und ihre Geometrien wurden mit MM2-Kraftfeldmethoden51 optimiert und als Sybyl Mol2 gespeichert. Die in silico ADME-Tox-Tests im Zusammenhang mit SAPE wurden mit der Software ACD/Labs I-Lab 2.0 (Advanced Chemistry Development Inc, Toronto, Kanada) durchgeführt.

Das molekulare Andocken von SAPE und zwei anderen etablierten entzündungshemmenden Wirkstoffen, nämlich Indomethacin und Ibrupofen, wurde gegen COX-2 (PDB-ID: 4PH9) mit Molegro Virtual Docker (MVD) 6.01 (CLC bio, Aarhus, Dänemark) durchgeführt. Ein gitterbasierter Hohlraumvorhersagealgorithmus wurde verwendet, indem ein diskretes Gitter mit einer Auflösung von 0,8 Å verwendet wurde, um das Protein abzudecken, und anschließend eine Kugel mit einem Radius von 1,4 Å platziert wurde. Die Kugel wurde auf Überlappungen mit anderen Kugeln überprüft und die gefundenen Hohlräume wurden nach ihrem Volumen eingestuft21. Für Docking-Simulationen wurden die Bindung und die Seitenkette auf eine Toleranz von 1,7 und eine Stärke von 0,7 eingestellt, und der RMSD-Schwellenwert (Root Mean Square Deviation) für die mehreren Cluster-Posen wurde auf 2,00 Å festgelegt. Der Docking-Algorithmus wurde auf 1.500 maximale Iterationen, 50 Simplex-Evolutionsgrößen und mindestens 100 Läufe für jede Verbindung eingestellt. Die molekularen Posen wurden auf der Grundlage des MolDock- und Rerank-Scores eingestuft, visualisiert und die besten Docking-Treffer für die Ligand-Protein-Wechselwirkungsanalyse ausgewählt.

MD-Simulationsstudien wurden für die besten Andocktreffer gegen den angedockten Protein-Ligand-Komplex durchgeführt. Die Ligandentopologie und die Atomladungen wurden mit dem PRODRG-Server52 generiert, wobei der Ladungswert auf „voll“ und die Chiralität auf den Standardwert ohne weitere Energieminimierung eingestellt wurde. Die Systeme wurden unter Verwendung des Gromos 43a1-Kraftfelds verarbeitet, in dem das Protein-Ligand-System in Wasser eingetaucht war und die Energien minimiert wurden, gefolgt von NVT- (kanonisch) und NPT-Gleichgewichten (isotherm-isobar). Die äquilibrierten Strukturen wurden einer 20-ns-MD-Simulation unterzogen und die Flugbahn wurde analysiert und für das RMSD-Rückgrat aufgezeichnet.

Die Konformation der besten Andockposition SAPE wurde exportiert und DFT-Berechnungen wurden mit Gaussian 09 durchgeführt. Theoretische Berechnungen wurden im Grundzustand unter Verwendung des DFT/B3LYP/6–31-Basissatzes durchgeführt. Die Schätzmethode wurde als erweiterte Huckel-Methode mit gemischtem HOMO- und LUMO-Orbital festgelegt. Die Molekülorbitalenergien wurden zur Berechnung der Bandenergielücke ΔELUMO-HOMO berücksichtigt.

Die erforderliche Genehmigung der Ethikkommission für die Verwendung von menschlichem Blut wurde von der Ethikkommission der Tezpur University (TUEC) der Tezpur University, Tezpur, eingeholt (Protokoll Nr. DoRD/TUEC/10-14/4361 vom 28.03.2014). Von allen Freiwilligen wurde vorab die Einwilligung eingeholt, Blut zu spenden, um die für dieses Experiment benötigten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) und roten Blutkörperchen (RBCs) zu erhalten. Alle Zellen wurden in einer stabilen Umgebung mit 5 % CO2 bei 37 °C gezüchtet. PBMCs wurden durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert und in RPMI-1640-Medium (3 × 103/200 µL), ergänzt mit 10 % FBS, in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät. CaCo-2-Zellen wurden in MEM-Medium mit 20 % fötalem Rinderserum kultiviert, HepG-2-Zellen wurden in DMEM-Medium kultiviert und MCF-7-Zellen wurden in MEM-Medium mit 10 % FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml kultiviert. L-Streptomycin.

Die Erythrozyten wurden aus dem Blut isoliert, mit PBS (pH 7,4) gewaschen, 10 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert und dann 2 % der Erythrozytensuspension (ES) in Kochsalzlösung resuspendiert. Die Reaktionsmischung enthielt 100 μl ES, 0,1 % Triton 10 Minuten. Die Freisetzung von Hämoglobin wurde durch photometrische Analyse des Überstands bei 576 nm bestimmt. Verwendet 0,1 % Triton X-100 (als Positivkontrolle) und PBS (als Negativkontrolle), um eine 100 % bzw. 0 % Hämolyse zu erreichen53.

Die PBMC-, HepG-2-, CaCo-2- und MCF-7-Zellen (2 × 103) wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät und 48 Stunden lang mit steigenden Konzentrationen (25, 50, 100 und 200 µg/ml) SAPE behandelt 37 °C, 5 % CO2. Danach wurden 20 µL (5 mg/ml in PBS) MTT-Lösung in jede Vertiefung gegeben und 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach dem Entfernen des Mediums wurden die Formazone in DMSO gelöst und die optische Dichte bei 570 nm gemessen. Das Hemmverhältnis der Zelllebensfähigkeit wurde in Bezug auf Kontrollzellen berechnet, die in drogenfreien Medien kultiviert wurden54.

Die Wirkung von SAPE auf die Lebensfähigkeit von MCF-7-Zellen wurde auch durch den Trypanblau-Farbstoff-Ausschlusstest bewertet. Die Zellen (2 × 103) wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen (25, 50 und 100 µg/ml) SAPE in 0,1 % DMSO kultiviert und 48 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden insgesamt 0,2 ml trypsinisierte Zelllösung mit 0,5 ml 0,4 % Trypanblau in PBS gemischt und nach 5 Minuten wurden die gefärbten (toten) und ungefärbten (lebensfähigen) Zellen mit einem Hämozytometer gezählt31.

Die Verbindungen nämlich. SAPE, Salicylsäure und Phenylethylalkohol (25, 50 und 100 µg/ml) wurden auf ihre Wirksamkeit bei der Hemmung der COX-2-Produktion getestet und mit Indomethacin verglichen. Im stimulierten Zelltest wurden die CaCo-2-Zellen in MEM-Medien vorinkubiert, wie zuvor erwähnt (Abschnitt „Kultur von PBMCs, HepG-2-, CaCo-2- und MCF-7-Zellen“) in Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindungen für 1 Std. Lipopolysaccharide (LPS) aus Escherichia coli 0111: B4 (10 µg/ml) wurden dann zur Zellsuspension gegeben und 48 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 weiter inkubiert. Nach dem Entfernen des Mediums wurden die Zellen mit PBS gewaschen, in eiskalten Zellextraktionspuffer (0,1 g/ml) gegeben und mit einem Perlenrührer (607 EUR, BioSpec Products, USA) lysiert. Der Überstand des Gewebelysats wurde durch Zentrifugation (12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C) gesammelt und die Freisetzung von Cox-2 wurde unter Verwendung eines ELISA-Kits für menschliches COX-2 (RAB1034, Sigma-Aldrich, USA) wie folgt gemessen Die Anweisungen des Herstellers und die Messwerte wurden in einem Mikroplattenlesegerät (GloMax Explorer, Promega, USA) erfasst.

Für den direkten Sequestrierungstest von COX-2 wurde ein fluorimetrisches COX-2-Inhibitor-Screening-Kit (MAK399, Sigma Aldrich, USA) verwendet. Der Assay basierte auf dem fluorometrischen Nachweis von Prostaglandin G2, dem vom COX-Enzym erzeugten Zwischenprodukt. Alle Testparameter wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt und die Fluoreszenz wurde sofort im kinetischen Modus mit einem Mikroplatten-Lesegerät bei λEx = 535 nm/λEm = 587 nm bei 25 °C für 5–10 Minuten gemessen. Die IC50-Werte für jede der Verbindungen wurden mit der Software CompuSyn (ComboSyn, Inc.) berechnet.

MCF-7-Zellen mit 1 × 105 Zellen/Well wurden mit verschiedenen Konzentrationen (25, 50 und 100 μg/ml) SAPE behandelt. Nach 48-stündiger Inkubation wurden sowohl anhaftende als auch schwimmende Zellen durch Trypsinisierung gesammelt, zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, über Nacht bei -20 °C in eiskaltem 70 % Methanol fixiert und anschließend mit Propidiumiodid (20 µg/ml) inkubiert RNase A (200 µg/ml) für weitere 30 Minuten bei 37 °C. Anschließend wurde die Zellzyklusverteilung mit einem Durchflusszytometer (BD FACS LSR III, BD Biosciences, USA) analysiert. Schließlich wurde der Prozentsatz der Zellen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus mit der BD Diva-Software bestimmt.

Für den quantitativen Nachweis der interzellulären ROS-Erzeugung wurden MCF-7-Zellen mit einer Dichte von 1 × 105 in Kulturplatten mit 6 Vertiefungen für 24 Stunden ausgesät, gefolgt von einer Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen (25, 50 und 100 μg/ml) SAPE für 48 Std. Anschließend wurden die Zellen trypsinisiert und mit PBS gewaschen und 30 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln mit 25 mM Dichlorfluordiacetat gefärbt und die relativen ROS-Werte der Zellen wurden mit FCA 30 quantifiziert.

Auf die Behandlung von MCF-7-Zellen, wie im vorherigen Abschnitt „Zellzyklusanalyse“ erwähnt, folgte eine 30-minütige Inkubation mit 400 μl 50 μM Rhodamin 123® bei 37 °C unter vertikalem Schütteln in Abständen von 5 Minuten. Die Zellen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und die Fluoreszenzintensität von Rhodamin 123® wurde mittels FCA gemessen, wobei die Anregungs- und Emissionswellenlängen auf 488 nm bzw. 525–530 nm festgelegt waren. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) repräsentiert daher die zellulären Werte des intrazellulären mitochondrialen Membranpotentials (MMP) 30.

Wie in 2.5.1 erwähnt, wurden MCF-7-Zellen (1 × 105 Zellen/ml) mit verschiedenen Konzentrationen (0, 50 und 100 μg/ml) SAPE behandelt. Danach wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 15 °C und 3000 U/min zentrifugiert und das Pellet zweimal mit PBS gewaschen. Das Pellet wurde in 50 µL PBS resuspendiert und 25 µL der Suspension wurden 10 Minuten lang mit 2 µL Acridinorange (AO) und Ethidiumbromid (EB)-Mischung (100 µg/ml-1:1) gemischt und aufbewahrt im Inkubator bei 37 °C. Die Zellen wurden dann auf einem Glasobjektträger mit Deckglas montiert und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Leica DM300, Deutschland) betrachtet30.

Für die qualitative Analyse der intrazellulären Autophagie mittels Fluoreszenzmikroskopie29 wurde die Bildgebung durch Aussäen der Zellen auf einer mit Deckglas beladenen 6-Well-Platte mit 1 × 105 Zellen/Well erreicht. Anschließend wurden die Zellen mit SAPE behandelt und wie in 4.6.1 beschrieben verarbeitet. Schließlich wurden die Zellen nach dem Waschen mit PBS mit AO angefärbt und auf ein Mikroskop montiert und Bilder wurden unter Verwendung geeigneter Filtereinstellungen in einem Verbundmikroskop (Leica DM3000, USA) aufgenommen.

Anschließend wurden, wie in 2.5.1, MCF-7-Zellen (1 × 105 Zellen/ml) mit verschiedenen Konzentrationen (0, 50 und 100 μg/ml) SAPE behandelt. Dabei wurden die Medien entfernt und die Zellen 15 Minuten lang bei 37 °C mit 1 μg/ml AO gefärbt, anschließend mit PBS gewaschen und sofort per FCA analysiert.

Dies geschah nach Olive und Banáth32. Kurz gesagt, 0,4 ml MCF-7-Zellen (2 × 104 Zellen/ml) wurden mit 1,2 ml 1 % Agarose bei 40 °C gemischt und 1,2 ml dieser Zellsuspension wurden auf der mit Agarose bedeckten Oberfläche eines vorgefertigten Behälters abgesetzt. beschichteter (1 % Agarose) Objektträger. Die Objektträger wurden dann vorsichtig in Lyselösung (2 % Sarkosyl, 0,5 M Na2EDTA und 0,5 mg/ml Proteinase K, pH 8,0) bei 4 °C getaucht und 20 Stunden lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde es 30 Minuten lang in Elektrophoresepufferlösung (pH 8,5) getaucht und 25 Minuten lang einer Elektrophorese im gleichen Puffer unterzogen. Die Färbung erfolgte mit 2,5 µ/ml Propidiumiodid in destilliertem Wasser und die Zellen wurden mithilfe der Open Comet-Software analysiert (50 Kometenbilder pro Objektträger), indem einzelne Kometenbilder auf die Fläche des Kometen und die Länge des Kometenschweifs untersucht wurden.

Die Tierversuche wurden mit Albino-Ratten (Rattus norvegicus der Sorte Wistar) im Defence Research Laboratory, Tezpur (CPCSEA-Reg.-Nummer: 1127/bc/07/CPCSEA), Assam, durchgeführt. Die erforderliche Genehmigung der Ethikkommission für die Durchführung der Tierversuche wurde vom Institutional Animal Ethical Committee (IAEC), Defence Research Laboratory, Tezpur, eingeholt (Protokoll Nr. 01/Mai/2016 vom 03.06.2016). Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Darüber hinaus folgte die Berichterstattung über die Studien mit Ratten den Empfehlungen der ARRIVE-Richtlinien.

Die Ratten (2 Monate alt) wurden bei (20 ± 1) °C, (60 ± 5) % relativer Luftfeuchtigkeit und einem Licht/Dunkel-Zyklus (12 h:12 h) unter spezifischen pathogenfreien Barrierebedingungen gehalten. Nagetierfutter und Wasser wurden nach Belieben verabreicht. Es wurde ein Vorbehandlungsmodell der Arzneimittelverabreichung verwendet und sie wurden nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen mit der gleichen Anzahl von Männern und Frauen eingeteilt. Gruppe RG-CI: Kolitis-induzierte Gruppe ohne jegliche Behandlung (n = 8); Gruppe RG-CF: kolitisfreie Kontrollgruppe ohne jegliche Behandlung (n = 8); Gruppe RG-SP: Kolitis-induzierte Gruppe, behandelt mit SAPE (n = 8); Gruppe RG-IM: Kolitis-induzierte Gruppe, behandelt mit Indomethacin (n = 8) und RG-PO: Pfotenödem-induzierte Modellgruppe (n = 8).

Bei einer anderen Gruppe von Ratten (n = 8) wurde ein Pfotenödem induziert, indem 0,15 ml 0,1 % Carrageen in den subplantaren Bereich direkt unter dem lateralen Malleolus beider linken Pfoten injiziert wurden. Anschließend wurden SAPE und Indomethacin (10 mg/kg Körpergewicht) transdermal verabreicht. Das Pfotenvolumen wurde nach 0, 1, 3 und 5 Stunden mit einem digitalen Plethysmometer (Orchid Scientific, Indien) gemessen und der Ödemprozentsatz wurde nach Upadhyay et al.55 ausgedrückt.

Von Tag 1 bis Tag 16 wurden SAPE und Indomethacin allen Mitgliedern der jeweiligen Gruppen (Gruppe RG-SP und RG-IM) in Dosierungen von 250 mg bzw. 1,5 mg pro kg Körpergewicht verabreicht. Nach Ablauf von 4 Stunden nach der letzten Dosis wurden Ratten der Gruppen RG-CI, RG-SP und RG-IM mit einer intraperitonealen Injektion von LPS aus Escherichia coli 0111: B4 in einer Dosis von 5 mg/kg Körpergewicht provoziert. Alle Ratten wurden nach 24-stündiger LPS-Exposition durch CO2-Erstickung eingeschläfert. Post mortem wurden Dickdarm und Dünndarm präpariert und mit kaltem 1 × PBS, das Penicillin/Streptomycin (100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) enthielt, mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail gespült, dann der Länge nach geöffnet und gründlich mit PBS gewaschen. Darmsegmente (0,5–1,0 cm), 2 cm vom Anus entfernt, wurden gesammelt und in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert. Die Gewebe wurden in pyrogen-/endotoxinfreien Röhrchen gelagert und vor der Analyse bei –80 °C eingefroren.

Das Körpergewicht aller Ratten wurde jeden Tag vor der Behandlung aufgezeichnet und die Geschwindigkeit der Körpergewichtszunahme berechnet. Die DAI-Werte wurden berechnet, indem die kombinierten Werte für Gewichtsverlust, Stuhlkonsistenz und Stuhlblutung addiert und diese Summe durch 356 dividiert wurden.

Die Gewebe wurden mit 3 % Glutaraldehyd fixiert, mit 0,1 M Natriumcacodylatpuffer gewaschen und erneut mit 0,1 % Osmiumtetroxid in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer fixiert. Die Dehydratisierung erfolgte in einer Reihe von 30–100 % Aceton, gefolgt von einer Trocknung in Tetramethylsilan bei 4 °C. Die Mikrostrukturen wurden mit einem Rasterelektronenmikroskop (JEOL JSM-6390LV, SEM, Oxford) bei 500-facher und 1000-facher Vergrößerung und einer Beschleunigungsspannung von 20 kV untersucht.

Der Grad der Lipidperoxidation wurde als Menge an gebildetem Malondialdehyd (MDA) ausgedrückt und mithilfe eines Lipidperoxidations-Assay-Kits (MAK085, Sigma-Aldrich, USA) analysiert, das eine Standardkurve von MDA im Bereich von 0 bis 20 nMol verwendet . Der Gehalt an Katalase (CAT) wurde mit einem Katalase-Assay-Kit (A22180, Invitrogen, USA) bestimmt und die Katalase-Konzentration wurde aus einer Standardkurve der Katalase (0 bis 4,0 U/ml) berechnet, in der 1 Einheit Enzym definiert war als die Menge, die 1,0 μmol H2O2 pro Minute bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 25 °C zersetzt. Der Test auf γ-Glutamyltransferase (GGT)-Aktivität wurde unter Verwendung eines GGT-Testkits (MAK089, Sigma-Aldrich, USA) und einer pNA-Standardkurve (0 bis 40 nmol/Well) durchgeführt, wobei eine Einheit GGT als Menge definiert wurde Enzym, das bei 37 °C 1,0 µmol pNA pro Minute erzeugt. Der Glutathion-S-Transferase (GST)-Aktivitätstest wurde mit dem GST-Assay-Kit (CS0410, Sigma-Aldrich, USA) durchgeführt und die GST-spezifische Aktivität wurde unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten von 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol berechnet (CDNB)-GST-Konjugat.

Die Gewebe wurden durch Ultraschallbehandlung mit RIPA-Puffer und 1 mM PMSF homogenisiert. Das Lysat wurde bei 13.000 × g zentrifugiert und der Überstand vor der Analyse weiter 1:10 bis 1:100-fach mit Standard-Verdünnungspuffer verdünnt. Der Test auf Interleukin 6 (IL-6) wurde mit dem Maus-IL-6-ELISA-Kit (KMC0061, Invitrogen, USA) und einer Ms-IL-6-Standardkurve (0–250 pg/ml) durchgeführt. Der Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-α) wurde mit dem Maus-TNF-α-ELISA-Kit (KMC3011, Invitrogen, USA) und einer Ms-TNF-α-Standardkurve (7,8–250 pg/ml) bestimmt.

Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die statistische Analyse wurde mittels ANOVA nach Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Ein Wert von P < 0,001, P < 0,01 und P < 0,05 wurde als Hinweis auf einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen angesehen.

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Die Autoren danken dem Direktor des Verteidigungsforschungslabors, Assam, Indien, und auch Professor Anand Ramteke, Abteilung für Molekularbiologie und Biotechnologie, Tezpur-Universität, Assam, Indien, für ihre Unterstützung für die freundliche Genehmigung der Durchführung der Tierversuche bzw. Zelllinienstudien .

Abteilung für Lebensmitteltechnik und -technologie, Tezpur University, Tezpur, Assam, Indien

Arup Jyoti Das & Sankar Chandra Deka

Abteilung für Molekularbiologie und Biotechnologie, Tezpur University, Tezpur, Assam, Indien

Geld Kumar Das & Salam Pradeep Singh

Fakultät für Chemie, NN Saikia College, Titabar, Assam, Indien

Partha Pratim Saikia

School of Environmental Sciences, Jawaharlal Nehru University, Neu-Delhi, Indien

Neelu Singh & Paulraj Rajamani

Abteilung für Pharmazeutische Technologie, Verteidigungsforschungslabor, Tezpur, Assam, Indien

Johirul Islam & Pronobesh Chattopadhyay

Fachbereich Physik, Tezpur University, Tezpur, Assam, Indien

Aftab Ansari

Abteilung für Material- und Biowissenschaften, Shizuoka Institute of Science and Technology, Fukuroi, Japan

Tatsuro Miyaji

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AJD und PPS haben die Konzeption übernommen; AJD, SPS, MKD und AA formulierten die Methodik und führten die formale Analyse und Untersuchung durch; PR und NS überwachten die Zelllinienstudien an der JNU, Delhi; JI und PC überwachten die Tierversuche bei DRL, T.; SCD und TM sorgten für die Bereitstellung von Ressourcen und überwachten die gesamte Arbeit; AJD und SCD übernahmen das Schreiben, dh die Vorbereitung des ursprünglichen Entwurfs, und alle Autoren überprüften das Manuskript.

Korrespondenz mit Sankar Chandra Deka.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Das, AJ, Das, MK, Singh, SP et al. Synthese von Salicylsäurephenylethylester (SAPE) und seine Bedeutung für die immunmodulatorische und krebsbekämpfende Rolle. Sci Rep 12, 8735 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-12524-7

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Eingegangen: 26. August 2021

Angenommen: 18. April 2022

Veröffentlicht: 24. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12524-7

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