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Oct 26, 2023

Induktor

Wissenschaftliche Berichte Band 12,

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 19445 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Trichoderma reesei ist ein weit verbreiteter Wirt zur Herstellung von Cellulase- und Hemicellulase-Cocktails für den Abbau von Lignocellulose-Biomasse. Hier berichten wir über eine genetische Modifikationsstrategie für industrielles T. reesei, die die Enzymproduktion mit einfacher Glucose ohne Induktoren wie Cellulose, Lactose und Sophorose ermöglicht. Zuvor war bekannt, dass das mutierte XYR1V821F oder XYR1A824V Xylanase und Cellulase induziert, indem es nur Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet, aber seine Enzymzusammensetzung war auf Xylanasen ausgerichtet und seine Leistung reichte nicht aus, um Lignocellulose effizient abzubauen. Daher untersuchten wir Kombinationen aus mutiertem XYR1V821F und konstitutiv exprimiertem CRT1, BGLR, VIB1, ACE2 oder ACE3, die als Cellulase-Regulatoren und wesentliche Faktoren für die Cellulase-Expression im T. reesei E1AB1-Stamm bekannt sind und zur Verbesserung der Enzymproduktivität und -Expression stark mutagenisiert wurden eine ß-Glucosidase für hohe Enzymleistung. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von ACE3 gegenüber dem mutierten XYR1V821F-exprimierenden Stamm die Cellulase-Expression förderte. Darüber hinaus führte die Koexpression dieser beiden Transkriptionsfaktoren auch zu einer erhöhten Produktivität, wobei die Enzymproduktivität 1,5-fach höher war als bei der herkömmlichen Einzelexpression von mutiertem XYR1V821F. Darüber hinaus war diese Produktivität im Vergleich zur Produktivität mit einer erhöhten Einzelexpression von ACE3 um das 5,5-fache höher. Obwohl die DNA-Bindungsdomäne von ACE3 als wesentlich für die induktorfreie Cellulaseproduktion angesehen wurde, stellten wir außerdem fest, dass ACE3 mit einer teilweise verkürzten DNA-Bindungsdomäne bei der Cellulaseproduktion wirksamer war, wenn es zusammen mit einem mutierten XYR1V821F exprimiert wurde. Diese Studie zeigt, dass die Koexpression der beiden Transkriptionsfaktoren, des mutierten XYR1V821F oder XYR1A824V und ACE3, zu einer optimierten Enzymzusammensetzung und einer erhöhten Produktivität führte.

Der Ersatz fossiler Brennstoffe durch umweltfreundliche und erneuerbare Energiequellen ist für den Aufbau einer nachhaltigen Gesellschaft von entscheidender Bedeutung. Lignozellulose-Biomasse ist der am häufigsten vorkommende nachhaltige Rohstoff für die Bioraffinerie- und Biokraftstoffproduktion. Daher könnte die effektive Nutzung von Lignozellulose-Biomasse zur Lösung des Problems beitragen1,2.

Um Lignozellulose-Biomasse als Rohstoff zu nutzen, ist es notwendig, Lignozellulose-Biomasse mithilfe von Cellulase und Hemicellulase in einfache Zucker zu hydrolysieren. Extrazelluläre Cellulasen und Hemicellulasen für den Abbau lignozellulosischer Biomasse werden hauptsächlich von Fadenpilzen produziert3. Insbesondere der Fadenpilz Trichoderma reesei (Teleomorph Hypocrea jecorna) ist ein bekannter Mikroorganismus, der große Mengen gemischter extrazellulärer Cellulase- und Hemicellulase-Enzyme für den Abbau von Lignocellulose-Biomasse produziert4,5. Man geht davon aus, dass es die Hauptstütze der kommerziellen Cellulaseproduktion sein wird, wenn man bedenkt, dass mit industriellen T. reesei-Stämmen bis zu über 80 g/l extrazelluläres Protein gewonnen werden können4,6,7,8. Dennoch erfordert die enzymatische Hydrolyse von Lignozellulose-Biomasse große Mengen an Lignozellulose-Enzymen, und die hohen Kosten der Enzyme gelten als großer Engpass bei der Produktion von Lignozellulose-Biokraftstoffen9,10,11,12.

Eine der besten Lösungen besteht darin, die Enzymproduktionskapazität zu steigern und kostengünstige Kohlenstoffquellen wie Glukose zu nutzen. Daher müssen die regulatorischen Mechanismen der Cellulase-Expression gut verstanden werden. Die Cellulase-Expression wird jedoch komplex durch mehrere Transkriptionsfaktoren (TFs) reguliert, die die Cellulase-Genexpression direkt oder indirekt beeinflussen können13. Daher sind die spezifischen Rollen verschiedener Faktoren und ihr gesamtes Regulierungsnetzwerk noch nicht vollständig verstanden. Frühere Studien haben die Rolle verschiedener Cellulase-Regulatoren gezeigt. Während XYR1, HAP2/3/5, ACE2, VEL1, ACE3, ARE1, CRZ1, STR1 und VIB1 positive Regulatoren sind, werden CRE1, ACE1, RCE1, CTF1, LAE1 und PAC1 als negative Regulatoren identifiziert14,15. Die Expression des Cellulase-Gens erfordert die Freisetzung der Kohlenstoffkatabolit-Repression (CCR)16. Daher gilt die Modifikation von Cellulase-Regulatoren durch Gentechnologie als wirksam.

Der Transkriptionsrepressor CRE1 ist ein Schlüsselregulator des CCR und hemmt bekanntermaßen indirekt die Cellulase-Expression in Fadenpilzen in Gegenwart von Glucose16. Bei Trichoderma lindert die Kürzung17, Deletion18 oder multisite-gerichtete Mutagenese19 von cre1 die CCR. Somit ist es möglich, die Cellulase-Genexpression in Gegenwart verschiedener Kohlenstoffquellen wie Glucose, Lactose, Sophorose und Cellulose deutlich zu steigern20,21,22,23. Insbesondere führt entweder die Deletion oder Kürzung von cre1 zu einer teilweisen Unterdrückung von Cellulase und Hemicellulase, wenn CRE1-mutierte Stämme in einem glukosehaltigen Medium kultiviert werden16,17,18,24. In einem Medium, das nur Glucose ohne induzierende Zucker enthält, kann der mutierte CRE1-Stamm das CCR jedoch nicht vollständig freisetzen. Daher unterdrückt es entweder die Expression oder unterdrückt oder aktiviert weder Cellulase noch Hemicellulase, was zu einer geringen Cellulaseproduktion führt. Darüber hinaus können die Repressoren ace125 und rce126 sowie cre1 deletiert werden, um die Expressionsniveaus des Cellulase-Gens zu verbessern, es wird jedoch angenommen, dass für die Expression Induktoren notwendig sind.

Im Gegensatz dazu führte XYR1, ein positiver Regulator, der für die Expression der meisten Cellulase- und Hemicellulase-Gene erforderlich ist, durch Modifikation zu der Möglichkeit, diese Gene ohne Induktoren zu exprimieren. XYR1 verfügt über eine DNA-Bindungsdomäne vom Zn(II)2Cys6-Typ, die direkt an die stromaufwärts gelegenen Regionen der Cellulase-/Hemicellulase-Gene bindet27,28. Eine Störung von xyr1 führt zu einem Cellulase-negativen Phänotyp29, was darauf hinweist, dass es ein wesentlicher Faktor für die Cellulase-Induktion ist. XYR1 fördert eine erhöhte Cellulase-Genexpression unter Bedingungen einer konstitutiven Überexpression, wohingegen es die Cellulaseproduktion in Medien mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle nicht erhöht12. Die Entwicklung von TFs wurde ebenfalls durchgeführt, um die Cellulase-Expression zu erhöhen. Obwohl künstliche TFs, die XYR1 mit anderen Transkriptionsfaktoren fusionieren, entwickelt wurden und versucht wurden, Cellulase konstitutiv unter Verwendung von Glukose als einziger Kohlenstoffquelle zu produzieren, hat die Proteinproduktivität nicht zu einer induzierten Produktion geführt30,31. Der mutierte XYR1V821F- oder XYR1A824V-exprimierende Stamm exprimierte Xylanase und Cellulase sogar in Glucose als einziger Kohlenstoffquelle und verbesserte die Proteinproduktivität8,32,33. Dennoch reichten die durch das mutierte XYR1V821F oder XYR1A824V induzierten Enzyme aufgrund ihrer hohen Xylanase- und niedrigen Cellulase-Zusammensetzung nicht für den effizienten Abbau von Lignocellulose aus32,33. Um Cellulase/Hemicellulasen auch in Medien mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle in ähnlichen Mengen wie dem induzierten Zustand zu produzieren, gingen wir davon aus, dass es notwendig ist, Faktoren hinzuzufügen, die die Cellulase-Expression in Zusammenarbeit mit XYR1 aktivieren, und suchten nach kooperativen Faktoren mit mutiertem XYR1V821F zu exprimieren.

Die Transkriptionsaktivatoren ACE234, ACE335 und VIB136 waren mutmaßliche kooperative Faktoren. Darüber hinaus wurden CRT137,38, ein auf Zellulose reagierender Transporter, der an der Regulierung der xyr1-Genexpression beteiligt ist, und BGLR39, ein β-Glucosidase-Aktivator, als solche berücksichtigt.

ACE2 ist ein Transkriptionsfaktor, der die Transkriptionsaktivierung von cbh1, cbh2, egl1, egl2 und xyn2 in T. reesei durch Zelluloseinduktion verstärkt34. ACE2 ist jedoch nicht an der Sophorose-Induktion beteiligt. ACE2 bindet an das gleiche Promotormotiv wie XYR1, und Phosphorylierung und Dimerisierung sind Voraussetzungen für die Bindung von ACE2 an seinen Zielpromotor40.

Es ist bekannt, dass ACE3 bei T. reesei nach Induktion mit Laktose an der Cellulaseproduktion beteiligt ist35. ACE3 interagiert mit XYR1, um die Cellulaseproduktion zu initiieren41. Die Einführung mehrerer Genkopien von ace3 steigert die Cellulase-Genexpression und reguliert die Xylanase-Genexpression35. Darüber hinaus kann C-terminal verkürztes ACE3 unter nicht induzierten Bedingungen unter Verwendung von Glucose ein hohes Maß an Cellulase- und Hemicellulase-Expression induzieren und die Expression unter induzierten Bedingungen unter Verwendung von Laktose oder einem Glucose-Sopholose-Gemisch weiter verbessern42,43. Es zeigt eine verbesserte Induktion von Cellulase sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit eines Induktors. Darüber hinaus verbesserte der Stamm, der Wildtyp-XYR1 oder mutiertes XYR1A824V und C-terminal verkürztes ACE3 überexprimierte, die Gesamtmenge an sezerniertem Protein mit Laktose als Kohlenstoffquelle. Wenn jedoch Glucose als einzige Kohlenstoffquelle verwendet wurde, führte eine weitere Überexpression von mutiertem XYR1A824V zusätzlich zu C-terminal verkürztem ACE3 nicht zu einer weiteren Verbesserung42.

In T. reesei ist VIB1 auch für die Cellulaseproduktion essentiell und fungiert als wichtiger Regulator der Cellulase-Induktion36,44. Ein Vergleich der Δvib1- und Δxyr1-Transkriptome unter Verwendung von Zellulose als Kohlenstoffquelle zeigte eine hohe Überlappungshäufigkeit zwischen Zellulose-induzierten Genen, die durch VIB1- und XYR1-Ziele reguliert werden45. Dies legt nahe, dass VIB1 die Cellulase-Genexpression teilweise über XYR145 reguliert.

CRT1 gilt als einer der wichtigsten Transporter, die an der Cellulase-Induktion in T. reesei beteiligt sind37,38. Es wurde festgestellt, dass seine Deletion die Cellulase-Genexpression nach Induktion mit Cellulose und Laktose vollständig aufhebt38. Kürzlich wurde bestätigt, dass CRT1 Laktose, Cellobiose, Glucose und Soporose transportiert46. Wenn XYR1 unter glukosehaltigen Bedingungen überexprimiert wird, blieb die crt1-Transkription außerdem auf einem relativ niedrigen Niveau47.

BGLR, ein β-Glucosidase-Aktivator, ist ein Transkriptionsfaktor mit einer DNA-Bindungsdomäne vom Typ Zn(II)2-Cys639. Eine Funktion von BGLR besteht darin, bestimmte β-Glucosidase-Gene hochregulieren39. Die Mutante mit deletiertem bglr-Gen zeigte eine erhöhte Cellulaseproduktion während des Cellobiose-Wachstums.

Wir untersuchten, ob mutiertes XYR1V821F und jeder der fünf Berichten zufolge damit verbundenen Faktoren die Regulierung der Cellulase- und Hemicellulase-Produktion unter induktorfreien Bedingungen unter Verwendung von Glukose als Kohlenstoffquelle beeinflussen.

Wir haben einen abgeleiteten Stamm von PC-3-7 verwendet, einem Hochleistungs-Enzym-produzierenden Stamm von T. reesei, der produktiver ist und tendenziell weniger CCR in der Glukose aufweist48,49,50. Es ist bekannt, dass T. reesei einen vollständigen Satz an Cellulasen absondert, wenn er mit Induktoren wie Cellulose, Cellobiose und Sophorose kultiviert wird5,51. Im Gegensatz dazu sind die CBH- und EG-Aktivitäten von T. reesei bekanntermaßen höher als die anderer Mikroorganismen, ihre BGL-Aktivität ist jedoch geringer als die von Cellulasemischungen anderer Organismen52. Dies führt zu einer Akkumulation von Cellobiose und einer anschließenden Produkthemmung von CBH, wodurch die Effizienz der enzymatischen Hydrolyse verringert wird. Um dieses Problem zu lösen, verbessert die Zugabe von BGL wirksam die Enzymleistung. Die Produktionskosten können durch Überexpression des BGL in T. reesei gesenkt werden. Der E1AB1-Stamm besitzt ein β-Glucosidase-Gen aus Aspergillus aculeatus (Aabgl) im PC-3-7-Stamm52,53,54.

Unser Ziel war es, einen Stamm zu entwickeln, der keinen Induktor für die Cellulaseproduktion benötigt, indem wir E1AB1 als praktischeren Enzym produzierenden Stamm verwendeten. Wir haben versucht, Cellulase durch Coexpression der fünf Kandidatenfaktoren und des mutierten XYR1V821F zu exprimieren, das unter nichtinduzierenden Bedingungen eine Xylanaseproduktion in hohem Maße induziert. In dieser Studie wurde der Mangel einer unzureichenden Cellulase-Induktion durch konstitutive Expression von mutiertem XYR1V821F und ACE3 beseitigt. Daher berichten wir, dass eine kostengünstige Produktion von Verzuckerungsenzymen ohne Cellulase-Induktoren erreicht werden kann.

Um die Expression von mutiertem XYR1V821F und seinen kooperativen Kandidatenfaktoren zu kombinieren, waren zwei genomische Insertionsstellen erforderlich, um mutiertes XYR1V821F und jeden Faktor zu exprimieren. Daher verwendeten wir die ace1- und rce1-Genregionen, die Transkriptionsrepressoren kodieren, als Insertionsstellen.

Zunächst wurde eine Störung der Repressorgene ace1 und rce1 durchgeführt, um den Effekt der Deletion zu bestätigen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Proteinproduktivität der Stämme E1AB1, Δace1 und Δrce1 unter den nicht-induzierenden Bedingungen mit Glucose als Kohlenstoffquelle im Vergleich zu den induzierenden Bedingungen mit Cellulose als Kohlenstoffquelle im Elternstamm E1AB1 auf weniger als 10 % reduziert war (Abb . 1a). Darüber hinaus veränderte die Störung von ace1 oder rce1 die Zusammensetzung der sekretorischen Proteine ​​nicht, wie in Abb. 1b dargestellt. Es wurde eine durch einen offenen Pfeil gekennzeichnete Bande hoher Intensität gefunden (Abb. 1b, Spuren 2–4) und durch Nano-LC-MS/MS-Analyse als Protein der Glycosidhydrolase-Familie 55 (GH55) (Trire2_121746) identifiziert. Es wurde festgestellt, dass dieses Protein der β-1,3-Glucanase Lam55A von Phanerochaete chrysosporium ähnelt (zusätzliche Datei, Tabelle S1). Dies weist darauf hin, dass in den drei Stämmen mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle eine geringe Cellulaseproduktion beobachtet wurde.

Auswirkungen der konstitutiven Expression von V821F-mutiertem XYR1 und der Störung von Repressoren auf die Glukosekultur. (a) Extrazelluläres Protein aus der Kultivierung von Proben nach 72, 96 und 120 h. Der Trichoderma reesei-Stamm E1AB1 wurde in Schüttelkolben auf einem Induktionsmedium mit 3 % Cellulose kultiviert, und die rekombinanten Stämme E1AB1Δace1, E1AB1Δrce1, E1AB1-X (Δace1-Pact1-xyr1V821F) und E1AB1-XΔrce1 wurden auf einem nichtinduzierenden Medium mit 3 % Zellulose kultiviert % Glukose. (b) SDS-PAGE-Analyse der sekretierten Proteine ​​nach 72 Stunden. T. reesei-Stamm E1AB1 mit 3 % Zellulose (Spur 1) und 3 % Glucose (Spur 2) Kulturen und rekombinanten Stämmen E1AB1Δace1 (Spur 3), E1AB1Δrce1 (Spur 4), E1AB1-X (Spur 5) und E1AB1-XΔrce1 (Spur 6) mit 3 % Glukosekulturen. Eine offene Pfeilspitze zeigt die bestätigte Glukosekultur an (Spuren 2–4). Geschlossene Pfeilspitzen zeigen deutlich überexprimierte Proteine ​​an, die wahrscheinlich der Haupt-Xylanase entsprechen (BXL1, XYN1, XYN2, Spuren 5 und 6). Das Gel wurde im Bereich von 15–250 kDa zugeschnitten und das Originalgel ist in der Zusatzdatei Abb. S4 dargestellt. Fehlerbalken geben Standardabweichungen an. Die statistische Signifikanz wurde durch einen zweiseitigen, ungepaarten Student-T-Test bestimmt. **p < 0,01.

Wir haben den act1-Promotor als konstitutiven Promotor ausgewählt, der von der Nutzung der Kohlenstoffquelle nicht betroffen ist und in RNAseq-Ergebnissen, die unter zellulose- und glukosehaltigen Kulturbedingungen im E1AB1-Stamm erhalten wurden, ähnliche Expressionsniveaus wie Pyruvatdecarboxylase 1 (Trire2_121534) zeigte. Eine Kassette mit XYR1V821F unter konstitutiv aktivem act1-Promotor wurde am ace1-Locus eingeführt, und der Stamm wurde E1AB1-X genannt. Der Stamm E1AB1-X produzierte unter nicht-induzierenden Bedingungen 2,08 g/L extrazelluläres Protein. Dies war eine vierfache Steigerung der extrazellulären Proteinproduktion im Vergleich zum Elternstamm (Abb. 1a). Darüber hinaus wurden in der SDS-PAGE-Analyse Unterschiede in den Bandenmustern beobachtet (Abb. 1b, geschlossene Pfeilspitzen). Basierend auf den geschätzten Molekulargewichten und einem früheren Bericht53 entsprachen die Proteinbanden wahrscheinlich den Haupt-Xylanasen (XYN1, XYN2) und β-Xylosidase (BXL1; Abb. 1b, Spur 5). Ihre Zusammensetzung unterschied sich jedoch von der der Proteine, die vom Elternstamm E1AB1 in einem induzierenden Zustand produziert wurden (Abb. 1b, Spuren 1 und 5), und die Bandenintensitäten, die den Cellulasen (CBH1, CBH2, EG1) entsprachen, waren ebenfalls niedrig.

Somit könnten Xylanasen durch konstitutive Expression des mutierten XYR1V821F auch unter induktorfreien Bedingungen produziert werden; Allerdings wurden Cellulasen nicht vollständig produziert. Eine weitere Störung des rce1-Gens im E1AB1-X-Stamm führte zu einer erhöhten Proteinproduktivität (Abb. 1a), jedoch zu keinen signifikanten Änderungen in der Enzymzusammensetzung (Abb. 1b, Spur 6). Daher wurde der rce1-Locus verwendet, um die Steigerung der Cellulaseproduktivität durch Co-Expression der möglichen kooperativen Faktoren für die Cellulaseproduktion zu testen.

Die homologe Rekombination von crt1, bglr, vib1, ace2 und ace3, Cellulase-Aktivatoren und für die Cellulase-Expression wesentlichen Faktoren erfolgte am rce1-Locus des E1AB1-X-Genoms, gefolgt von der konstitutiven Expression unter dem act1-Promotor. Die konstitutive Koexpression von CRT1, BGLR, VIB1 oder ACE2 im E1AB1-X-Stamm führte zu keinen signifikanten Veränderungen der sekretierten Proteinkonzentration (Abb. 2a) und der Banden mit Molekulargewichten, die Cellulasen wie CBH1, CBH2 entsprachen (Abb . 2b, Spuren 2–5). Im Gegensatz dazu zeigte der konstitutiv ACE3 exprimierende Stamm E1AB1-XA3 einen 1,5-fachen Anstieg der Proteinproduktion im Vergleich zu E1AB1-X (Abb. 2a). Die Analyse der Enzymzusammensetzung ergab eine verringerte Bande, die Xylanasen (XYN1, XYN2 und BXL1) entspricht, und einige Banden mit erhöhter Intensität, wie durch geschlossene Pfeile in E1AB1-XA3 angezeigt (Abb. 2b, Spur 6). Bei diesen Banden handelte es sich, wie durch Nano-LC-MS/MS-Analyse identifiziert, hauptsächlich um Cellulasen (CBH1, CBH2 und EG1), Xylanasen (BXL1 und XYN4) und kleine Mengen an Proteinen, die am Celluloseabbau beteiligt sind (SWO1, CIP2 und EG4). (Zusatzdatei Tabelle S2).

Koexpression von Faktoren, die an der Cellulase-Transkription im E1AB1-X-Stamm beteiligt sind. Der Trichoderma reesei-Stamm E1AB1-X wurde mit verschiedenen Faktoren, die sich auf die Cellulase-Expression beziehen, koexprimiert und in Schüttelkolben auf einem nicht induzierenden Medium mit 3 % Glucose kultiviert. (a) Extrazelluläres Protein aus Kultivierungsproben nach 96 h. (b) SDS-PAGE-Analyse der sekretierten Proteine ​​nach 72 Stunden in einer Glucosekultur von T. reesei E1AB1-X (Spur 1, Δace1-Pact1-xyr1V821F, als Kontrolle), E1AB1-XC (Spur 2, Δace1-Pact1- xyr1V821F und Δrce1-Pact1-crt1), E1AB1-XB (Spur 3, Δace1-Pact1-xyr1V821F und Δrce1-Pact1-bglr), E1AB1-XV (Spur 4, Δace1-Pact1-xyr1V821F und Δrce1-Pact1-vib1), E1AB1 -XA2 (Spur 5, Δace1-Pact1-xyr1V821F und Δrce1-Pact1-ace2) und E1AB1-XA3 (Spur 6, E1AB1-XA3, Δace1-Pact1-xyr1V821F und Δrce1-Pact1-ace3(PT)). Das Gel wurde im Bereich von 15–250 kDa zugeschnitten und das Originalgel ist in der Zusatzdatei Abb. S5 dargestellt. (c) Volumetrische Enzymaktivität des 72-Stunden-Kulturüberstands. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als die Enzymmenge, die 1 μmol p-Nitrophenol pro Minute und ml Kulturüberstand aus dem Substrat bei 50 °C produziert. Balkendiagramme zeigen die Aktivität relativ zu der von E1AB1-X. Fehlerbalken geben Standardabweichungen an. Die statistische Signifikanz wurde durch den zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Test bestimmt. **p < 0,01.

Um die Enzymaktivität des Kulturüberstands des ACE3-konstitutiv koexprimierenden Stamms zu messen, wurde pNPLase auf CBH1-Aktivität und pNPGase auf BGL-Aktivität gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass der Stamm E1AB1-XA3 im Vergleich zum Stamm E1AB1-X einen 4,9-fach höheren pNPLase-Wert und einen 5,5-fach höheren pNPGase-Wert aufwies. Im E1AB1-Stamm wird die β-Glucosidase aus A. aculeatus (Aabgl1) mithilfe des egl1-Promotors exprimiert. Der Anstieg der pNPGase-Aktivität lässt auf eine verstärkte Transkription des egl1-Promotors im E1AB1-XA3-Stamm schließen. Diese pNPGase- und pNPLase-Aktivitätswerte, die auf Cellulase-Aktivität hinweisen, stiegen etwa um das Fünffache. Während sich die pNPXase- und pNPX2ase-Aktivitätswerte, die die Xylanase-Aktivität anzeigen, um das 1,8- bzw. 0,8-fache änderten. Die Tatsache, dass sich die Xylanase-Aktivität im Gegensatz zu Cellulase nicht wesentlich verbesserte, legt nahe, dass ACE3 zu einer spezifischen Verbesserung der Cellulase-Expression beiträgt.

Darüber hinaus verschwand die unter nicht induzierbaren Bedingungen beobachtete GH55-Bande (Abb. 1b, Spuren 2–4 mit offener Pfeilspitze) im Überstand des konstitutiv exprimierenden ACE3-Stammes. Lam55A, das β-1,3-Glucan hydrolysiert, könnte den Stoffwechsel externer Nährstoffquellen regulieren55. Daraus wurde geschlossen, dass Cellulasen im E1AB1-XA3-Stamm auch in Abwesenheit von Induktoren induziert wurden und der Stamm dem aktiv induzierten Zustand für die Cellulaseproduktion ähnelte. Folglich fanden wir heraus, dass der E1AB1-XA3-Stamm, der die konstitutive Expression des mutierten XYR1V821F und ACE3 kombiniert, die Produktion von Xylanasen und eine hohe Ausbeute an Cellulasen ermöglicht, selbst unter induktorfreien Bedingungen.

Der Stamm E1AB1-XA3 wies auch in Abwesenheit von Induktoren eine hohe Cellulaseproduktivität auf, was darauf hindeutet, dass eine Kombination aus ACE3 und mutiertem XYR1V821F für eine Steigerung der Cellulaseaktivität wirksam ist (Abb. 2). Zusätzlich zur V821F-Mutation wurde zuvor berichtet, dass die A824V-Mutation eine der XYR1-Mutationen ist, die die Expression von Xylanase und Cellulase ohne Induktoren ermöglicht32. Um die potenziell nützlichen XYR1-Mutanten zu bestätigen, wurden daher V821F- und A824V-Mutanten mit einem glukoseblinden Phänotyp zusammen mit dem Wildtyp bewertet (Abb. 3a). Im Gegensatz dazu deuten Berichte darauf hin, dass in ace341,43 möglicherweise mehrere Transkriptionsstartstellen vorhanden sind. Das in Abb. 2 verwendete ace3 von E1AB1-XA3 wurde aus der JGI-Genomdatenbank abgeleitet (die ORF-Sequenzen (651 oder 629 Aminosäuren), dargestellt in http://genome.jgi.doe.gov/Trire2/Trire2.home.html). ) durch Verweis. Es wurden jedoch korrekte Introns und zwei mutmaßliche Transkriptionsstartstellen vorgeschlagen41,43. Die geschätzte vollständige Aminosäuresequenz betrug 734 Aminosäuren, und die in JGI registrierte Sequenz war eine teilweise verkürzte N-terminale DNA-Bindungsdomäne. Daher haben wir beide mutmaßlichen Translationsinitiationsstellen aus genomischer DNA geklont und die konstitutive Expression von teilweise verkürztem ACE3 (PT-ACE3) und ACE3 voller Länge (FL-ACE3) untersucht (weitere Einzelheiten finden Sie in der Zusatzdatei, Abb. S1). Darüber hinaus führten wir eine konstitutive Expression von XYR1 und ACE3 mittels nichthomologer Rekombination durch, um herauszufinden, ob eine Störung der beiden Repressoren (ace1 und rce1) wesentlich war. Die in dieser Studie verwendeten Stämme, Kohlenstoffquellen und Genotypen sind in der Zusatzdatei, Tabelle S3, aufgeführt.

Bestätigung der genetischen Kombinationen, die für eine hohe Cellulaseproduktion unter induktorfreien Bedingungen erforderlich sind. (a) Mutmaßliche Domäne von XYR1 und ACE3, die in der Studie verwendet wurde, Aminosäuremutationen in XYR1 und die vermutete Variante von ACE3. Kultivierungen im Schüttelkolben wurden mit 3 % Zellulose (Spur 1) und 3 % Glucose (Spur 2–9) durchgeführt. Die in dieser Abbildung verwendeten Stämme waren Spur 1 und 2: E1AB1, Spur 3: E1AB1-X (Δace1-Pact1-xyr1V821F), Spur 4: E1AB1-A3 (Δrce1-Pact1-ace3(PT)), Spur 5: E1AB1- XA3 (Δace1-Pact1-xyr1V821F und Δrce1-Pact1-ace3(PT)), Spur 6: E1AB1-XA3fl (Δace1-Pact1-xyr1V821F und Δrce1-Pact1-ace3(FL)), Spur 7: E1AB1-XA3nhr (Pact1- xyr1V821F und Pact1-ace3(PT) durch nicht-homologe Rekombination), Spur 8: E1AB1-X824A3nhr (Pact1-xyr1A824V und Pact1-ace3(PT) durch nicht-homologe Rekombination) und Spur 9: E1AB1-XwtA3nhr (Pact1-xyr1WT und Pact1-ace3(PT) durch nicht-homologe Rekombination). Die in dieser Abbildung verwendeten Kohlenstoffquellen, Stämme und Genotypen wurden in einer Zusatzdatei, Tabelle S3, organisiert. (b) SDS-PAGE sekretierter Proteine ​​nach 72-stündiger Kultivierung (2,5 μg Protein/Spur). Das Gel wurde im Bereich von 15–250 kDa zugeschnitten und das Originalgel ist in der Zusatzdatei Abb. S6 dargestellt. (c) Extrazelluläre Proteinkonzentration nach 96 Stunden. Relative Transkriptionsniveaus von xyr1 (d) und ace3 (e). Die Echtzeit-PCR wurde mit den nach 48 Stunden entnommenen Proben durchgeführt. Die Transkriptionsniveaus der Stämme pgk1 und E1AB1 in der Glukosekultur wurden zur Referenzberechnung bzw. Datennormalisierung gemessen und mit der ΔΔCt-Methode analysiert. Fehlerbalken geben Standardabweichungen an. Die statistische Signifikanz wurde durch einen zweiseitigen, ungepaarten Student-T-Test bestimmt. **a zeigte p < 0,01 für den Test mit Spur 5 (E1AB1-XA3) an und **b zeigte p < 0,01 für den Test mit Spur 7 (E1AB1-XA3nhr) an.

In allen Stämmen, die ACE3 konstitutiv exprimierten, bestand die enzymatische Zusammensetzung der sekretierten Proteine ​​hauptsächlich aus Cellulase (Abb. 3b, Spuren 4, 5, 6, 7, 8 und 9). Die Gesamtproteinproduktion des Stamms E1AB1-A3, der PT-ACE3 exprimiert (Abb. 3c, Spur 4) und des Stamms E1AB1-XwtA3, der ACE3 mit Wildtyp-XYR1 coexprimiert (Abb. 3c, Spur 9), betrug 0,57 g/l bzw. 0,51 g/L. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Koexpression von ACE3 mit dem mutierten XYR1V821F für eine hohe Produktivität wirksam war. Damit ein mutierter XYR1 kombiniert werden kann, muss er nicht V821F-spezifisch sein, sondern sollte zumindest einen glukoseblinden Phänotyp wie mutierter XYR1V821F oder XYR1A824V aufweisen (Abb. 3b, c, Spuren 7 und 8). Darüber hinaus war die Co-Expression von ACE3 mit teilweise verkürzten Sequenzen und Sequenzen voller Länge wirksam, die beide eine Cellulase-dominierte Zusammensetzung aufwiesen und eine höhere Produktivität zeigten als eine einzelne Expression von XYR1V821F (Abb. 3b, c, Spur 6). Allerdings war die Produktivität des Stammes E1AB1-XA3fl mit FL-ACE3 um 14 % niedriger als die des Stammes E1AB1-XA3 mit PT-ACE3 (Abb. 3c, Spur 5). Dieses Ergebnis war überraschend, da ACE3 mit einer teilweise verkürzten DNA-Bindungsdomäne eine überlegene Produktivität aufwies. Die Expression von mutiertem XYR1V821F und ACE3 durch nicht homologe Rekombination (Abb. 3c, Spur 7, Stamm E1AB1-XA3nhr) zeigte den gleichen Koexpressionseffekt wie oben. Die Proteinproduktivität war jedoch geringer als bei den ace1- und rce1-zerstörten E1AB1-XA3-Stämmen (Abb. 3c, Spur 5).

Die Transkriptmengen von xyr1 und ace3 wurden in den neun in Tabelle S3 aufgeführten Stämmen verglichen. Das gesamte xyr1-Transkript wurde mit einem Primerpaar in nicht mutierten Regionen gemessen und wurde speziell für WT, V821F und A824V durch die Entwicklung eines Reverse-Primers an der mutierten Position gemessen. Zur Messung von ace3-Transkripten verwendete Primer wurden anhand gemeinsamer Sequenzen für alle ace3 und in eindeutigen Sequenzen in voller Länge (Exon 2) oder teilweise verkürzt (innerhalb von Intron 2 bis Exon 3) entwickelt (zusätzliche Datei, Tabelle S4). Daher stiegen die xyr1-Transkriptwerte im E1AB1-X-Stamm um das 11,5-fache und exprimierten konstitutiv das mutierte XYR1V821F im Vergleich zum Elternstamm E1AB1 im Medium mit Glucose als Kohlenstoffquelle. Der Anstieg erfolgte nicht nur bei xyr1V821F, sondern auch bei xyr1WT (natives xyr1) um das 4,2-fache (Abb. 3d, Spuren 2 und 3). Darüber hinaus war die gesamte ace3-Transkription im E1AB1-X-Stamm um das 6,2-fache erhöht, obwohl die ace3-Expression nicht direkt gesteigert wurde (Abb. 3e). Dies weist darauf hin, dass die Expression von nativem xyr1 und ace3 direkt/indirekt durch mutiertes XYR1V821F deutlich verstärkt wird. Darüber hinaus stiegen im E1AB1-XA3-Stamm, der mutiertes xyr1V821F und PT-ace3 co-exprimiert, die gesamten xyr1- und ace3-Transkriptmengen im Vergleich zum Elternstamm um das 16,8- bzw. 8,9-fache an (Abb. 3d, e, Spur 5). ). Im Fall der Koexpression von xyr1WT und PT-ace3 ohne Verwendung von mutiertem xyr1 (Stamm E1AB1-XwtA3nhr) stiegen die Gesamttranskriptmengen von xyr1 und ace3 um das 6,7-fache (Abb. 3d, Spur 9) bzw. 3,7-fache (Abb. 3e, Spur 9). Die Gesamtmenge an sekretiertem Protein stieg jedoch nicht an (Abb. 3c, Spur 9). Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine bestimmte Menge an Gesamt-XYR1 oder mutiertem XYR1, wie etwa mutiertes XYR1V821F oder XYR1A824V, für eine hohe Cellulaseproduktion erforderlich ist.

Diese Ergebnisse zeigten auch, dass die konstitutive Expression des mutierten XYR1 mit einem glukoseblinden Phänotyp (wie V821F, A824V) und von ACE3 (vollständig und teilweise verkürzt) für eine hohe Cellulaseproduktion in Abwesenheit von Induktoren erforderlich war. Darüber hinaus trugen die teilweise Verkürzung der DNA-Bindungsdomäne von ACE3 und Störungen von ace1 und rce1 zu einer hohen Proteinproduktivität bei, und der Genotyp des E1AB1-XA3-Stammes erwies sich in dieser Studie als die wirksamste Kombination.

Wir analysierten die Genexpression und Aktivität von Cellulase und Xylanase in einer einzelnen Expression von XYR1V821F (Stamm E1AB1-X), einer einzelnen Expression von PT-ACE3 (Stamm E1AB1-A3) und einer Koexpression von XYR1V821F und PT-ACE3 (Stamm E1AB1). -XA3-Stamm).

Aufgrund der Wirkung der XYR1V821F-Mutation war die Transkription der Hauptcellulasen im E1AB1-X-Stamm etwa vier Größenordnungen höher als die des Elternstamms E1AB1 (Abb. 4a). Darüber hinaus führte die konstitutive Expression von PT-ACE3 im Stamm E1AB1-XA3 zu einem zusätzlichen 6,4-fachen Anstieg der Cellulase-Transkriptmengen im Vergleich zum Stamm E1AB1-X (Abb. 4a). Der Anstieg der Expression der wichtigsten Xylanasen Xyn1 und Xyn2 betrug maximal das 1,7-fache (Abb. 4a), was mit ihrer enzymatischen Aktivität übereinstimmte (Abb. 4b). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigten die vom E1AB1-XA3-Stamm produzierten Enzyme im Vergleich zum E1AB1-X-Stamm eine ähnliche Menge an Xylanase und einen spezifischen Anstieg der Cellulase-Komponenten (CBH1, CBH2, EG1) (Abb. 4c). Die Cellulase/Xylanase-Zusammensetzung des E1AB1-XA3-Stammes in der nicht induzierten Kultur unter Verwendung von Glucose war ähnlich der der induzierten Kultur des Elternstamms E1AB1 unter Verwendung von Cellulose (Abb. 4b, Zusatzdatei Abb. S2). Im Stamm E1AB1-A3 wurden die abbauenden Aktivitäten von pNPX2ase und pNPXase kaum nachgewiesen (Abb. 4b) und die Banden von BXL1, XYN1 und XYN2 konnten kaum identifiziert werden (Abb. 3b, Spur Nr. 4). Daher könnte die konstitutive Einzelexpression von ACE3 die Cellulaseproduktion aktivieren, die Xylanaseproduktion jedoch nicht vollständig aktivieren (Abb. 3c). Darüber hinaus betrugen die absoluten Mengen an CBH1, CBH2 und EG1 basierend auf den anhand von SDS-PAGE geschätzten Proteinkonzentrationen und -zusammensetzungen 0,24, 0,34 bzw. 1,25 g/L in den Stämmen E1AB1-X, -A3 und -XA3. Dies bestätigt eine synergistische Hochregulierung der Cellulase bei gleichzeitiger Expression von mutiertem XYR1V821F und ACE3 (Abb. 4c).

Analyse der Genexpression, Enzymaktivität, Zusammensetzung und Verzuckerung von mikrokristalliner Cellulose. (a) Relative Genexpression der wichtigsten Cellulasen und Xylanasen. Die Echtzeit-PCR wurde an der 48-Stunden-Kulturprobe mit Glucose als Kohlenstoffquelle durchgeführt. Die Transkriptionsniveaus der pgk1- und E1AB1-X-Stamm-RNA wurden zur Referenzberechnung bzw. Datennormalisierung gemessen und mit der ΔΔCt-Methode analysiert. (b) Die volumetrische Aktivität jedes Enzyms im Kulturüberstand, erhalten nach 72-stündiger Kultivierung mit Glucose als Kohlenstoffquelle. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als die Enzymmenge, die 1 μmol p-Nitrophenol pro Minute und ml Kultur des Überstands aus dem Substrat bei 50 °C produziert. Balkendiagramme zeigen die relative Aktivität zu E1AB1-X. (c) Die Konzentration jeder Enzymkomponente wurde aus der Enzymzusammensetzung und der Gesamtkonzentration des sekretierten Proteins berechnet. Die Zusammensetzungen wurden aus den Bandenmustern nach SDS-PAGE (siehe Zusatzdatei Abb. S2) berechnet, abgeleitet von E1AB1 (Kultivierung unter Verwendung von Cellulose: C und Glucose: G), E1AB1-X (G), E1AB1-A3 (G) und E1AB1-XA3 (G)-Stämme. Die Proteinkonzentrationen wurden aus dem 96-h-Wert bestimmt. (d) Verzuckerung mikrokristalliner Cellulose unter Verwendung der gleichen Proteindosis (2,0 mg Protein/g Cellulose). (e) Verzuckerung mikrokristalliner Cellulose unter Verwendung des gleichen Volumens Kulturüberstand (0,87 ml Kulturüberstand/g Cellulose). Fehlerbalken geben Standardabweichungen an. Die statistische Signifikanz wurde durch einen zweiseitigen, ungepaarten Student-T-Test bestimmt. **p < 0,01, *p < 0,05.

Die Verzuckerung von mikrokristalliner Cellulose wurde mithilfe von Enzymen bewertet, die unter induzierenden Bedingungen bei Verwendung von Cellulose oder unter nichtinduzierenden Bedingungen bei Verwendung von Glucose hergestellt wurden. Bei der Auswertung mit 2,0 mg Enzym pro g Cellulose setzte das Enzym, das vom Elternstamm E1AB1 produziert wurde, induziert mit Cellulose die höchste Menge an Glucose mit 26,8 g Glucose/L frei. Im Gegensatz dazu war das vom Stamm E1AB1-XA3 produzierte Enzym im nichtinduzierenden Zustand mit 22,5 g Glucose/l am besten (Abb. 4d). Das Enzym des Stamms E1AB1-A3 setzte 17,8 g Glucose/L frei. Dieses Ergebnis war 2,3-fach höher als das des Enzyms aus Stamm E1AB1-X (Abb. 4d). Wir schlussfolgerten, dass dies möglicherweise auf das hohe Zusammensetzungsverhältnis der Cellulasekomponenten im Protein zurückzuführen ist. Wie oben beschrieben betrug die Gesamtmenge der vom Stamm E1AB1-A3 produzierten sekretierten Enzyme jedoch 0,57 g/L (Abb. 4c) und die absolute Menge der Cellulase betrug 0,34 g/L. Im Gegensatz dazu enthielt der vom E1AB1-X-Stamm abgeleitete Enzymcocktail eine Proteinkonzentration von 2,09 g/L und war produktiver als E1AB1-A3, bestand jedoch hauptsächlich aus Xylanasen; als Ergebnis betrug die absolute Menge an Cellulasen 0,24 g/L. Daher war die von den Stämmen E1AB1-A3 und E1AB1-X produzierte Cellulasekomponente mit 1,25 g/L geringer als die des Stamms E1AB1-XA3. Daher wurde die Verzuckerung mit 0,87 ml des gleichen Volumens Kulturüberstand durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Enzym des Stammes E1AB1-A3 6,5 g Glucose/L freisetzte und das Enzym des Stamms E1AB1-X 7,5 g Glucose/L freisetzte, wobei die beiden Enzyme eine vergleichbare Leistung aufwiesen. Im Gegensatz dazu setzte das Enzym des Stamms E1AB1-XA3 eine deutlich höhere Menge frei, nämlich 19,9 g-Glucose/L (Abb. 4e). Dies legt nahe, dass der E1AB1-XA3-Stamm unter induktorfreien Bedingungen ein besseres Enzym produzieren kann als der bestehende Überexpressionsstamm XYR1V821F.

Es wurde festgestellt, dass der Stamm E1AB1-XA3 zwei wichtige Phänotypen aufweist: ein erhöhtes Cellulase-Zusammensetzungsverhältnis durch konstitutive Expression von ACE3 und eine hohe Proteinproduktivität unter nicht induzierenden Bedingungen durch Einführung von mutiertem XYR1V821F. Damit konnten wir die wichtigste Eigenschaft des cellulolytischen Enzyms erreichen, nämlich die erhöhte Cellulaseproduktion in einem nicht-induzierenden Produktionssystem.

Das zuvor beschriebene induktorfreie Enzymproduktionssystem von T. reesei unter Verwendung von mutiertem XYR1V821F oder XYR1A824V produzierte hauptsächlich Xylanase mit schwacher Aktivierung der Cellulase-Expression32,33. Daher haben wir eine genetische Modifikationsstrategie entwickelt, um sowohl Cellulase als auch Xylanase in der gleichen Menge wie unter induzierten Bedingungen zu produzieren. Dadurch konnten wir erfolgreich große Mengen Cellulase und Xylanase ohne Induktoren erzeugen. Eine verbesserte Cellulaseproduktivität unter Verwendung von Glucose als einziger Kohlenstoffquelle wurde durch die konstitutive Expression von mutiertem XYR1V821F oder XYR1A824V und ACE3, insbesondere ACE3, mit einer teilweise verkürzten DNA-Bindungsdomäne erreicht.

In diesem Bericht führte die Co-Expression von XYR1V821F mit den mit der Cellulase-Regulation verbundenen Faktoren CRT1, BGLR, VIB1 oder ACE2 nicht zu einer Erhöhung der Cellulase-Expression (Abb. 2). Zuvor wurde berichtet, dass die Löschung dieser Faktoren zu einem Verlust oder einer Verringerung der Cellulase-Expression führt38,39,40,45. Diese Faktoren wurden auch durch die verstärkte Expression von XYR1 und ACE3 beeinflusst (zum Beispiel wird crt1 durch ACE338,47 reguliert). Dies deutet darauf hin, dass die Wirkung der Koexpression von XYR1V821F mit diesen Faktoren möglicherweise nicht aufgetreten ist, da ausreichende Mengen dieser Faktoren bereits durch die konstitutive Expression von mutiertem XYR1V821F und die anschließende Hochregulierung von ACE3 hochreguliert wurden (Abb. 3e, Spur Nr. 3). Im Gegensatz dazu wurde beobachtet, dass die Wirkung der ACE3-Koexpression zur verbesserten Cellulaseproduktion beiträgt (Abb. 2), was darauf hindeutet, dass es notwendig ist, die Expression von ACE3 über die Hochregulierung durch mutiertes XYR1V821F hinaus zu steigern. Es wurde zuvor berichtet, dass ACE4 direkt an den ace3-Promotor bindet und die ACE3-Expression reguliert, um die Cellulaseproduktion zu fördern56. Möglicherweise wird ACE3 nicht nur durch XYR1, sondern auch durch andere Faktoren, einschließlich ACE4, reguliert, was darauf hindeutet, dass eine verstärkte Expression von ACE3 durch andere Faktoren als XYR1 der Schlüssel zur Cellulase-Expression sein könnte. Zusätzlich zur Regulierung der Haupt-Cellulase-/Hemicellulase-Expression ist es auch möglich, dass kleinere Enzyme (die nicht unter der Kontrolle von XYR1 und ACE3 stehen) nicht exprimiert wurden, und eine weitere umfassende Analyse des Expressionsprofils verschiedener Regulatoren und Glycosidhydrolase-Familien erfordert zukünftige Eingriffe.

XYR1 wurde als einer der Schlüsselregulatoren der Cellulase- und Xylanaseproduktion untersucht, sein detaillierter Regulierungsmechanismus bleibt jedoch unklar. In unserer Studie zeigte die Koexpression von Wildtyp-XYR1 und PT-ACE3 (Stamm E1AB1-XwtAnhr) keinen Anstieg der Cellulaseproduktivität im Vergleich zum konstitutiv exprimierenden PT-ACE3 (Stamm E1AB1-A3) (Abb. 3). Darüber hinaus stieg in einem von Rut-C30 abgeleiteten Industriestamm die Cellulaseproduktion in Abwesenheit von Cellulase-Induktoren nicht an, wenn der native xyr1-Promotor durch konstitutive Promotoren wie Promotoren von Phosphoglyceratkinase, Histon 3 und dem Basic-Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktor ersetzt wurde Gene12. Im Gegensatz dazu führte die Überexpression von Wildtyp-XYR1 unter Verwendung des kupferreprimierbaren Promotors Ptcu1 im T. reesei-Stamm QM9414 zu einer hohen Cellulaseproduktion in mit Glucose angereicherten Kulturen57. Obwohl der act1-Promotor in dieser Studie als konstitutiv exprimierter Promotor ausgewählt wurde, reichte er möglicherweise nicht aus, um das Expressionsniveau von Wildtyp-XYR1 zu erhöhen, und möglicherweise könnte die Cellulase durch Überexpression von Wildtyp-XYR1 induziert werden. Im Gegensatz dazu führte die Expression von mutiertem xyr1V821F unter Verwendung desselben act1-Promotors zu einer bemerkenswerten Xylanase-Produktion unter nicht induzierenden Bedingungen (Abb. 1). Es wird auch vermutet, dass eine posttranslationale Modifikation von XYR1 für eine vollständige Aktivierung der Cellulase- und Hemicellulase-Gentranskription erforderlich sein könnte12. Mutationen in der sauren Aktivierungsdomäne von XYR1, wie A824V oder V821F, könnten posttranslationale Modifikationen nachahmen und zumindest die Xylanase-Expression in geringeren Mengen aktivieren als Wildtyp-XYR1. Daher wurde vermutet, dass die Expressionsprofile von Cellulase/Hemicellulase selbst bei Verwendung der gleichen Promotorstärke in Wildtyp und mutiertem XYR1 unterschiedlich sind, und weitere Untersuchungen sind erforderlich, um festzustellen, ob das Expressionsniveau von mutiertem XYR1V821F in dieser Studie optimal war Wirkung der Promotorstärke auf die Ansteuerung des Wildtyps/mutierten XYR1.

Es wurde gezeigt, dass ein weiterer Modifikationsfaktor, ACE3, eine wichtige Rolle bei der Cellulase-Regulation spielt, seine funktionelle Analyse bleibt jedoch unklar. ACE3 in T. reesei NG14 und abgeleiteten RUT-C30- und RL-P37-Stämmen weist eine Verkürzung um 11 Aminosäuren am C-Terminus auf, was zu einer höheren Cellulaseproduktivität führt42. Darüber hinaus haben Luo et al. berichteten über eine hohe Cellulaseproduktion auch unter induktorfreien Bedingungen durch Überexpression von ACE3 mit C-terminaler Verkürzung von 7–17 Aminosäuren, wobei der Stamm RL-P37 als Elternstamm verwendet wurde43. In diesem berichteten System hatte keines der ace3 einen vollständigen Wildtyp-C-Terminus43. Im Gegensatz dazu hatte in dieser Studie im E1AB1-Stamm, der vom PC-3–7-Stamm abgeleitet war, ace3 im Genom einen vollständigen C-Terminus und ace3 mit weiter verstärkter Expression wies keine C-terminale Mutation auf. Unter nicht induzierenden Bedingungen wurde jedoch durch Koexpression mit mutiertem XYR1V821F eine hohe Cellulaseproduktion erreicht (Abb. 3a). Luo et al. schlugen vor, dass die C-terminalen 17 Aminosäuren von ACE3 entweder die Repressordomäne selbst oder Teil einer Domäne sein könnten, die mit dem Repressor interagiert43. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die C-terminale Mutation von ACE3 für die induktorfreie Produktion von Cellulase nicht wesentlich ist und dass ihre Interaktion mit mutiertem XYR1V821F direkt oder indirekt seine Hemmfunktion am C-Terminus von ACE3 freisetzen kann.

Darüber hinaus haben Luo et al. berichteten, dass eine DNA-Bindungsdomäne vom Zn(II)2Cys6-Typ mit allen sechs Cysteinen am N-Terminus und einer spezifischen Mutation am C-Terminus für die induktorfreie Cellulaseproduktion erforderlich war43. Im Gegensatz dazu steigerte in der vorliegenden Studie die Expression von FL-ACE3 mit einer vollständigen N-terminalen DNA-Bindungsdomäne die Cellulaseproduktivität. Überraschenderweise war jedoch PT-ACE3 mit einer unvollständigen DNA-Bindungsdomäne produktiver (Abb. 3). Es wurde vorgeschlagen, dass ACE3 Homodimere mit ACE3 und Heterodimere mit XYR141 bildet und PT-ACE3 konstitutiv exprimiert, das möglicherweise mit nativem ACE3 (mit vollständiger DNA-Bindungsdomäne), PT-ACE3, nativem XYR1 oder mutiertem XYR1V821F interagiert. Darüber hinaus wurden die Transkriptspiegel von FL-ace3 unter induzierten Bedingungen unter Verwendung von Zellulose nicht signifikant erhöht, und die Transkripte, die hauptsächlich PT-ace3 entsprachen, nahmen zu (Abb. 3e, Spur 1), was die vorherigen Berichte stützt . Daher ist ACE3 mit DNA-Bindungsfähigkeit für die Cellulase-Expression erforderlich, jedoch nicht unbedingt für die Erhöhung des Expressionsniveaus. Es wurde angenommen, dass ACE3, das PT-ACE3 entspricht, die Cellulase-Expression durch Dimerbildung und Wechselwirkungen mit anderen Faktoren auch während der Cellulase-Produktion mit Induktoren reguliert. Die DNA-bindende Domäne von ACE3 wird als Gal4-ähnlicher zweikerniger Zn(II)2Cys6-Cluster klassifiziert; Es ist bekannt, dass Gal4 DNA als Homodimer bindet58. Daher wurde spekuliert, dass Homodimere mit PT-ACE3 (mit PT-ACE3 oder nativem FL-ACE3), bei denen ein Teil der DNA-Bindungsdomäne verkürzt war, die Fähigkeit zur DNA-Bindung verlieren. Die Ergebnisse der Koexpression und der Regionen mit erhöhter Transkription während der induzierten Produktion in Abb. 3e legen jedoch nahe, dass die Anwesenheit von PT-ACE3 die Cellulaseproduktion positiv reguliert. Daher kann je nach Zustand auch die DNA-Bindung von ACE3 eine Rolle bei der Hemmung spielen. Es wurde auch angenommen, dass die Heteromerisierung mit XYR1, das DNA binden kann, die Cellulaseproduktion aktivieren könnte, aber weitere Untersuchungen zur Funktion von ACE3 mit teilweiser Verkürzung der DNA-Bindungsdomäne wären erforderlich.

Die Loci ace125 und rce126, die zum Einfügen von xyr1V821F und anderen mit der Cellulase-Regulation zusammenhängenden Faktoren verwendet wurden, waren bekannte Repressoren. In dieser Studie war ihre Störung nicht wesentlich und trug nicht zu einer verbesserten Cellulasezusammensetzung bei, obwohl die Gesamtkonzentration des sekretierten Proteins erhöht war (Abb. 3b, c). Die Enzymproduktivität des E1AB1-XA3-Stamms unter Verwendung von Glucose war im Vergleich zu den Stämmen E1AB1-X und E1AB1-A3 verbessert, jedoch etwas schlechter als die des Elternstamms E1AB1 unter Verwendung von Cellulose (Abb. 1a, 3c, 4c). Dies schien weitgehend von der Eigenschaft der Zellulose als Kohlenstoffquelle und ihrer Induzierbarkeit abzuhängen. Glukose ist extrem leicht assimilierbar und wird schnell verbraucht; Daher war es in dieser Studie nach 48 Stunden erschöpft (Zusatzdatei Abb. S3). Im Gegensatz dazu wird Cellulose nicht leicht assimiliert und langsam abgebaut, wobei über einen langen Zeitraum Cellobiose und Glucose freigesetzt werden. Außerdem wird davon ausgegangen, dass die Wahrscheinlichkeit einer CCR-Induktion geringer ist. Der in dieser Studie verwendete E1AB1-Stamm ist ein industrieller Stamm, der einer wiederholten Mutationszüchtung unterzogen wurde, und die cre1-Mutation50 und die Störung von α-Tubulin (tubB)54 haben verschiedene unterdrückende Vorschriften, einschließlich CCR, beseitigt. Allerdings war selbst in diesem Stamm die Enzymproduktion gering, während die Glukosekonzentrationen hoch waren (zusätzliche Datei, Abb. S3). Luo et al.43 erwähnten auch, dass die Produktion von (Hemi-)Cellulase erst erfolgt, nachdem die Glukose unter einen bestimmten Schwellenwert gesunken ist und die CCR nicht vollständig überwunden wurde. Im gegenwärtigen Zustand sind Praktiken zur Vermeidung von CCR (z. B. Fed-Batch-Kultur59,60) notwendig, um zu einer hohen Cellulaseproduktivität zu führen, die der von Kulturen mit Cellulose entspricht, und die konstitutive Expression von Aktivatoren wie XYR1 und ACE3 allein kann die CCR nicht überwinden . Daher sind neben der Modifikation dieser Aktivatoren weitere Untersuchungen der Repressionsmechanismen erforderlich.

Aufgrund seiner hohen Produktionsfähigkeit ist T. reesei ein vielversprechender Wirt für die heterologe Proteinproduktion. Allerdings ist die Verwendung des herkömmlichen Enzymproduktionssystems auf Zellulosebasis für die heterologe Proteinproduktion schwierig61,62. Wenn die Cellulase-Gene durch Gene für die Proteine ​​von Interesse ersetzt werden, kann Cellulose nicht abgebaut werden und der Induktor wird nicht freigesetzt, was die Fähigkeit zur Proteinproduktion verringert. Im Gegensatz dazu werden große Mengen nativer Cellulasen kontaminiert, wenn die Cellulase nicht zerstört wird62. Frühere Berichte zeigten eine heterologe Proteinproduktion unter Verwendung der Promotoren xyn1 und xyn2 mit xyr1A824V63. Die Ergebnisse dieser Studie deuten jedoch darauf hin, dass es möglich geworden ist, extrem starke Cellulase-Promotoren wie cbh1 und cbh2 für die heterologe Proteinproduktion ohne die gleichzeitige Produktion von Cellulase zu verwenden. Von solchen starken Cellulase-Promotoren wird erwartet, dass sie großartige Produktivitätswerkzeuge darstellen, mit denen verzuckernde Enzyme für die Bioethanolproduktion und verschiedene wertvolle Proteine ​​exprimiert werden können.

Die in dieser Untersuchung verwendeten T. reesei-Stämme sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die T. reesei-Stämme E1AB153 und E1AB1Δpyr4 (Uracil auxotroph) wurden freundlicherweise von Prof. W. Ogasawara (Nagaoka University of Technology) zur Verfügung gestellt. Die Stämme wurden auf Kartoffel-Dextrose-Agar-Platten (PDA; Difco Laboratories, Detroit, MI) gehalten.

Für die Enzymproduktion vor der Kultur wurden 4 × 105 Sporen jedes Stamms in 2 ml Basalmedium48, das 1 % (Gew./Vol.) Glucose enthielt, in einem 10-ml-Kulturröhrchen inokuliert. Die Sporen wurden mit einem Thoma-Hämozytometer (Sunlead Glass Corp.) gezählt. Das Basismedium bestand aus 0,14 % (Gew./Vol.) (NH4)2SO4, 0,2 % (Gew./Vol.) KH2PO4, 0,03 % (Gew./Vol.) CaCl2·2H2O, 0,03 % (Gew./Vol.) MgSO4 · 7H2O, 0,1 % (Gew./Vol.) /v) Polypepton, 0,05 % (w/v) Hefeextrakt, 0,1 % (w/v) Tween 80 und 0,1 % (w/v) Spurenelementlösung in 50 mM Na-Tartrat-Puffer (pH 4,0). Die Spurenelementlösung enthielt 6 mg H3BO3, 26 mg (NH4)6Mo7O24·4H2O, 100 mg FeCl3·6H2O, 40 mg CuSO4·5H2O, 8 mg MnCl2·4H2O und 200 mg ZnCl2 in 100 ml destilliertem Wasser. Die Vorkultivierung erfolgte durch zweitägiges Schütteln bei 220 U/min bei 28 °C. Für jede der Hauptkulturen wurden 500 μl der Vorkultur in 50 ml Basalmedium geimpft, das 3 % (Gew./Vol.) pulverisierte Zellulose (KC FLOCK W-400G, Nippon Paper Industries) oder Glucose und 1,28 % (Gew./Vol.) enthielt ) Diammoniumhydrogencitrat in einem 500 ml Erlenmeyerkolben. Die Hauptkultur wurde 3–5 Tage lang bei 28 °C und 220 U/min geschüttelt. Zur Probenahme wurden die Zellen durch 5-minütige Zentrifugation bei 16.000 g aus der Kulturbrühe entfernt und der Überstand durch einen 0,20 μm Celluloseacetat-Membranfilter (13CP020AN; Advantec, Toyo Roshi Kaisha) filtriert. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Die interessierenden Gene wurden aus der genomischen DNA des T. reesei-Stammes PC-3–7 amplifiziert und ein Vektorfragment wurde durch inverse Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von pUC118 (Takara Bio) als Matrize amplifiziert. Die amplifizierten Fragmente, die unter Verwendung von Primern entworfen wurden, die eine SwaI-Spaltungsstelle hinzufügten, wurden mit einem In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) gemäß dem Protokoll des Herstellers ligiert. Escherichia coli DH5a wurde als Klonierungswirt verwendet und ein NucleoSpin® Plasmid Miniprep Kit (Takara Bio) wurde zur Reinigung der Plasmid-DNA verwendet. Weitere Einzelheiten zum geklonten Gen und den Primern finden Sie in der Zusatzdatei, Tabelle S5. Das Vektorfragment pUC-K017 wurde durch inverse PCR erzeugt; Es wurde vom ligierten ace1-inserierten Plasmid (pUC-K003) und der Pyr4-Markerkassette (pUC-K016) abgeleitet. Ein inverses PCR-Fragment des ace1-Disruptionskonstrukts (pUC-K017) und Fragmente des act1-Promotors, xyr1 und cbh1-Terminators wurden ligiert, um das Plasmid ΔAce1-Pact1-xyr1-pyr4 (pUC-K019) zu erzeugen. Unter Verwendung dieses Plasmids als Matrize wurde eine inverse PCR durchgeführt, um Valin an Position 821 zu Phenylalanin zu mutieren, um ΔAce1-Pact1-xyr1V821F-pyr4 (pUC-K020) zu erhalten, und um Alanin an Position 824 zu Valin zu mutieren, um ΔAce1-Pact1-xyr1A824V- zu erhalten. pyr4 (pUC-K021). Auf die gleiche Weise wurden ein inverses PCR-Fragment des rce1-Disruptionskonstrukts (pUC-K018) und Fragmente des act1-Promotors, ORFs (crt1, bglr, vib1, ace2, PT-ace3, FL-ace3) und des cbh1-Terminators hergestellt ligiert, um die Plasmide pUC-K022, pUC-K023, pUC-K024, pUC-K025, pUC-K026 bzw. pUC-K027 zu erzeugen. Für PT-ace3 und FL-ace3 wurde pUC-K010 als Matrize verwendet, um einen Vorwärtsprimer basierend auf den beiden Arten mutmaßlicher Initiationscodons zu entwerfen. Weitere Einzelheiten zur Vektorkonstruktion und den verwendeten Primern finden Sie in der Zusatzdatei, Tabelle S6.

Plasmide wurden vor der Transformation von T. reesei mit SwaI linearisiert, oder das PCR-Produkt wurde unter Verwendung einer modifizierten Protoplasten-PEG-Methode64 transformiert, bei der 20 mg/ml Yatalase (Takara Bio) als protoplastierendes Enzym anstelle von Novozyme 234 verwendet wurden (Novozymes Bagsværd, Dänemark). Die transformierten Protoplasten wurden auf Minimaltransformationsmedium [2,0 % (w/v) Glucose, 18,27 % (w/v) Sorbitol, 0,5 % (w/v) (NH4)2SO4, 0,2 % (w/v) CaCl2, 0,06 % (w/v) plattiert % (Gew./Vol.) MgSO4, 0,21 % (Gew./Vol.) CsCl und 0,1 % (Gew./Vol.) Spurenelementlösung in 100 mM KH2PO4-Puffer (pH 5,5)] für den Pyr4-Marker. Die Spurenelementlösung enthielt 500 mg FeSO4·7H2O, 200 mg CoCl2, 160 mg MnSO4·H2O und 140 mg ZnSO4·7H2O in 100 ml destilliertem Wasser. Nach zweiwöchiger Inkubation bei 30 °C wurden die Kandidatentransformanten zur Einzelkolonie-Isolierung mehrere Tage lang bei 30 °C zweimal auf selektiven Platten (jeweils Minimaltransformationsmedium ohne Sorbitol) ausgestrichen. Einzelne Kolonien wurden dann eine Woche lang bei 30 °C auf PDA-Platten übertragen, um die Bildung von Konidien zu ermöglichen. Gemäß dem Protokoll des Herstellers wurde ein Transformant durch Kolonie-PCR unter Verwendung von KOD One (Toyobo) bestätigt. Um die resultierenden Transformanten erneut mit dem PDA-Medium zu transformieren, das 0,2 % (Gew./Vol.) 5-Fluororotsäure (5-FOA)-Monohydrat enthielt, wurde ein Stamm ausgewählt, der erneut eine 5-FOA-Resistenz erlangte (Pyr4-Popout durch homologe Rekombination).

Gemäß dem Protokoll des Herstellers wurde die Proteinkonzentration mithilfe des Bradford-Proteintests (Bio-Rad) mit Rinder-Gammaglobulin als Standard bestimmt. Die Glukosekonzentration im Überstand wurde mit dem Glucose CII Test Wako Kit (Wako Chemicals) quantifiziert. Konkret wurden 150 μl der Reaktionslösung zu 1 μl der verdünnten Überstände in einer 96-Well-Platte gegeben, gut gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorption aller Proben und Standards wurde bei 505 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices) gemessen.

Das durch Zentrifugation gesammelte Zellpellet wurde nach 48 Stunden leicht entwässert und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Ein Metallkegel wurde in die gefrorene Probe gelegt, bevor sie mit einem Multi-Beads Shocker (Yasui Kikai Corp.) bei 1700 U/min für 10 s zerkleinert wurde, und die RNA-Extraktion wurde anschließend nach Angaben des Herstellers mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) durchgeführt Protokoll. Der gDNA-Verdau und die cDNA-Synthese wurden mit ezDNase™ Enzyme (Invitrogen) bzw. SuperScript™ IV VILO™ Master Mix (Invitrogen) durchgeführt. RT-qPCR-Experimente wurden mit Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mixes (Agilent) durchgeführt und die Transkriptionsniveaus wurden unter Verwendung der ΔΔCt-Methode unter Verwendung des pgk1-Gens als Normalisierer und E1AB1 (Abb. 3d, e) oder E1AB1-X bewertet (Abb. 4a) Dehnung als Kalibrator. Alle Proben wurden in mindestens drei unabhängigen biologischen Experimenten analysiert. Die für die Echtzeit-PCR verwendeten Primer wurden mit Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) entwickelt und sind in der Zusatzdateitabelle S4 aufgeführt.

Die SDS-PAGE wurde mit Any kD Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels (Bio-Rad) 35 Minuten lang bei 200 V durchgeführt. Das Gel wurde 5 Minuten lang aktiviert und mit dem ChemiDoc MP-Bildgebungssystem (Bio-Rad) abgebildet. Als Molekularmassenmarker wurde Precision Plus Protein Unstained Standard (5 μl; Bio-Rad) verwendet. Sofern nicht anders angegeben, wurden 2,5 μg Protein in jede Vertiefung geladen. Die Gele wurden im Bereich von 15–250 kDa zugeschnitten, da unter 15 kDa keine klaren Banden festgestellt wurden (das Originalgel aus Abb. 1b, 2b und 3b wurde in Abb. S4, S5 und S6 dargestellt, siehe Zusatzdatei). Das Molekulargewicht der Proteinbanden wurde mit der Image Lab-Software (BiFio-Rad) geschätzt und die Proteinbanden wurden mit Anmerkungen versehen, indem die Positionen verwendet wurden, die den zuvor gemeldeten Cellulasen und Xylanasen entsprechen53. Die Proteinidentifizierung mithilfe von Nano-LC-MS/MS-Systemen wurde in Japan Proteomics Co. LTD durchgeführt.

Die enzymatischen Aktivitäten von Cellobiohydrolase, β-Glucosidase, Xylanase und β-Xylosidase wurden unter Verwendung der Substrate p-Nitrophenyl-β-d-lactosid (pNPL), p-Nitrophenyl-β-d-glucopyranosid (pNPG) und p-Nitrophenyl gemessen -β-Xylobiosid (pNPX2) bzw. p-Nitrophenyl-β-d-xylopyranosid (pNPX). Die Reaktionen wurden in 50 mM Natriumacetat bei pH 5,0 und 50 °C für 10 Minuten durchgeführt und durch Zugabe eines Volumens 1 M Na2CO3 beendet. Das freigesetzte p-Nitrophenol wurde durch Messung der Absorption bei 420 nm quantifiziert. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als die Enzymmenge, die bei 50 °C 1 μmol p-Nitrophenol pro Minute produziert. Die Celluloseverzuckerung wurde im 1-ml-Maßstab in 9-ml-Glasflaschen mit Schraubverschluss bei einer Beladung von 5 % (Gew./Vol.) mikrokristalliner Cellulose (Avicel® PH-101, Sigma-Aldrich) in 100 mM Natriumacetatpuffer pH durchgeführt 5,0, unter Verwendung einer Enzymbeladung von 2,0 mg Protein/g Cellulose. Die Proteinkonzentration wurde wie oben erwähnt bestimmt. Die Reaktion wurde 72 Stunden lang bei 50 °C unter Schütteln mit 150 U/min durchgeführt. Nach der Verzuckerung erhaltene Proben wurden filtriert (0,2 μm) und die Glukosekonzentration wurde mithilfe eines enzymatischen Assays und eines Multifunktions-Biosensors BF-7 (Oji Scientific Instruments) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen.

Alle Experimente wurden mit mindestens drei unabhängigen Proben durchgeführt. Fehlerbalken geben die Standardabweichung (SD) des Mittelwerts der Dreifachbestimmungen an. Die statistische Signifikanz wurde durch den zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Test bestimmt. Innerhalb jeder Versuchsreihe wurde p < 0,05 als signifikant angesehen.

Die in dieser Studie verwendeten Protein- und Nukleotidsequenzen können von Uniprot unter den folgenden Zugangs-IDs referenziert werden: ACE1_G0RCC6, RCE1_G0RBV8, XYR1_G0RLE8, CRT1_G0RGH7, BGLR_G0RVU2, VIB1_G0R8Z5, ACE2_G0RKV9, ACE3 (teilweise verkürzt)_G0RIA0, ACE3 ( in voller Länge)_A0A5C1J077.

β-Glucosidase

β-Xylosidase

Cellobiohydrolase

Unterdrückung des Kohlenstoffkataboliten

Endoglucanase

Polymerase Kettenreaktion

p-Nitrophenyl-β-d-glucopyranosid

p-Nitrophenyl-β-d-lactosid

p-Nitrophenyl-β-d-xylopyranosid

p-Nitrophenyl-β-xylobiosid

Xylanase

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Prof. Wataru Ogasawara von der Nagaoka University of Technology für die Bereitstellung des T. reesei E1AB1-Stamms und Prof. Ishii von der Kobe University für die Vertiefung unserer Überlegungen durch die Diskussion dieser Studie. Wir möchten Editage (www.editage.com) für die Bearbeitung in englischer Sprache danken.

Biological Science Research, Kao Corporation, 1334 Minato, Wakayama, Wakayama, 640-8580, Japan

Toshiharu Arai, Sakurako Ichinose, Nozomu Shibata, Hiroshi Kakeshita, Hiroshi Kodama, Kazuaki Igarashi und Yasushi Takimura

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TA, SI und H.Ka. entwarf die Studie; TA analysierte die Ergebnisse und verfasste das Manuskript; SI beteiligte sich an der Konstruktion von Stämmen und der Genanalyse; H.Ka. überarbeitete das Manuskript; NS, H.Ka., H.Ko., KI und YT haben das Manuskript überprüft und kommentiert. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Hiroshi Kakeshita.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Arai, T., Ichinose, S., Shibata, N. et al. Induktorfreies Cellulase-Produktionssystem basierend auf der konstitutiven Expression von mutiertem XYR1 und ACE3 im Industriepilz Trichoderma reesei. Sci Rep 12, 19445 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23815-4

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Eingegangen: 23. April 2022

Angenommen: 07. November 2022

Veröffentlicht: 14. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23815-4

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