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Jun 18, 2023

Eine einfache Methode, um ein Vesikel in einem Gel herzustellen, einzuschließen und zu verformen

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 5375 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Wir stellen eine einfache Methode zur Herstellung riesiger Lipid-Pseudovesikel (Vesikel mit einer öligen Kappe an der Oberseite) vor, die in einem Agarosegel eingeschlossen sind. Die Methode kann nur mit einer normalen Mikropipette durchgeführt werden und beruht auf der Bildung eines Wasser/Öl/Wasser-Doppeltröpfchens in flüssiger Agarose. Wir charakterisieren das produzierte Vesikel mit Fluoreszenzbildgebung und stellen das Vorhandensein und die Integrität der Lipiddoppelschicht durch die erfolgreiche Insertion von \(\alpha \)-Hämolysin-Transmembranproteinen fest. Schließlich zeigen wir, dass das Vesikel durch Eindrücken der Geloberfläche leicht und ohne Eingriff mechanisch verformt werden kann.

Vesikel werden häufig verwendet, um die zelluläre Kompartimentierung nachzuahmen und in vitro spezifische biologische Funktionen mit Bottom-up-Ansätzen zu reproduzieren1,2. In vielen neueren Studien wurde der Schwerpunkt auf die Einkapselung komplexer biologischer Reaktionen innerhalb der Vesikel gelegt, um Proteine3 oder Gene4 zu exprimieren oder die Proteinfilamente des Zytoskeletts wie den Aktin-Cortex5 oder Mikrotubuli-Astern6 wiederherzustellen und zu untersuchen. Viele andere Arbeiten zielen darauf ab, die Eigenschaften der Zellmembran nachzuahmen, beispielsweise die Membranfusion7,8,9 oder die Zellkommunikation, durch die Insertion von Transmembranproteinen in Liposomen. Insbesondere wurden mechanosensitive Kanäle10,11 in die Membran von Liposomen eingefügt, was wiederum die Messung ihrer Leitfähigkeit unter mechanischer Belastung ermöglicht.

Die Herstellung von Vesikeln beruht normalerweise entweder auf Hydratationsmethoden oder invertierten Emulsionsvorlagen. Hydratationsmethoden beruhen auf dem Quellen getrockneter Lipidfilme in einem wässrigen Puffer12,13. Sie sind relativ einfach zu bedienen, liefern jedoch polydisperse Vesikelgrößen und eine relativ inhomogene Einkapselungseffizienz14,15,16. Die Produktionsrate unilamellarer Vesikel kann durch den Einsatz elektrischer Felder (Elektroformationsmethoden17) verbessert werden, aber fragile Proteine ​​können durch die angelegten Felder beschädigt werden18,19und die Technik ist auch auf Puffer mit niedrigen Ionenkonzentrationen beschränkt. Invertierte Emulsionstemplates hingegen basieren auf dem erzwungenen Durchgang von Wasser-in-Öl-Emulsionströpfchen durch eine Wasser/Öl-Grenzfläche5,20. Diese Methode kann in mikrofluidischen Chips21,22,23,24 entwickelt werden und ergibt monodisperse Vesikelgrößen, die durch die Abmessungen des mikrofluidischen Kanals begrenzt sind.

Bei beiden Methoden (Hydratation oder Emulsionen) werden die resultierenden Vesikel im äußeren Medium dispergiert, was zusätzliche Schritte erfordert, um sie in verschiedenen Umgebungen zu handhaben oder zu übertragen (Mikropipetten25, optisches Einfangen26 usw.). Diese zusätzlichen Schritte, die auf spezifischen technischen Fähigkeiten beruhen, erschweren die Replikation vieler Experimente und die Erfassung umfangreicher Statistiken zu den Systemeigenschaften. Insbesondere zur Untersuchung von Mechanotransduktionsprozessen ist es erforderlich, die Vesikel mechanisch zu stimulieren. In der Praxis wurde dies typischerweise durch lokale Membranverformungen (Pipettensaugung27, Flüssigkeitsströme28,29, AFM30,31) erreicht. Allerdings reproduzieren diese Methoden die Natur mechanischer Störungen im Gewebe nicht originalgetreu. Darüber hinaus übersehen sie die mechanische Kopplung zwischen Zellen und ihrer biologischen viskoelastischen Umgebung.

Wir schlagen hier eine neue Technik vor, die eine vielseitige Plattform für die unkomplizierte Herstellung biomimetischer Pseudovesikel (ein Vesikel mit einer öligen Kappe oben) bietet, aber auch deren Einfangen und nicht-invasive mechanische Anregung ermöglicht.

(a–f) (obere Reihe) Skizze der Methode zur Herstellung der Doppelemulsion. Die Farben Grün/Orange/Blau stehen für interne/Öl/externe Phasen. (untere Reihe) Hellfeldbilder. Maßstabsbalken = 500 \(\mu \)m. Das erzeugte Doppelemulsionströpfchen in(f) sedimentiert in der flüssigen Agarose und wird schließlich als Agarosegel geliert. Gleichzeitig wird die umgebende Ölhülle an der Oberseite des Tröpfchens cremig und am unteren Teil bildet sich eine Lipiddoppelschicht. Wenige Minuten später hat sich das Pseudovesikel gebildet und ist im Gel eingeschlossen, wie in (g) skizziert. Unten: Fluoreszenzmakroskopische Aufnahme eines Pseudovesikels, beladen mit Carboxyfluorescein, eingeschlossen in einem Agarosegel. Maßstabsbalken = 200 \(\mu \)m.

Die Vesikel werden aus einer Wasser-in-Lipid-haltigen Öltröpfchenkonfiguration hergestellt, die in einer flüssigen, warmen Agaroselösung gebildet wird (Einzelheiten zu den Chemikalien finden Sie im Abschnitt „Methoden“). Wir zeichnen zunächst ein kleines Volumen (ca. 500 nL) der inneren wässrigen Phase (Abb. 1a) mit einer 2,5 \(\mu \)L-Mikropipette (Eppendorf). Zweitens bewegen wir die Pipette in den Öl-/Lipidbehälter und saugen etwa 50 nL davon ab (Abb. 1b), indem wir das Einstellrad der Mikropipette drehen, während die Spitze in das Öl eingetaucht ist. Die Pipettenspitze enthält somit ein Öl/Wasser-Sandwich. Zuletzt bewegen wir die Pipette in die warme Agaroselösung (Temperatur \(T\ca. 38\,^{\circ }C\), siehe Details im Abschnitt „Methoden“), wo wir das Öl/Wasser-Sandwich durch Rückwärtsdrehen ausstoßen Das Einstellrad der Mikropipette. Während dieser Austreibungsphase wächst zunächst die Ölphase zu einem Tröpfchen in der flüssigen Agarose (Abb. 1c), gefolgt von der darin wachsenden wässrigen Phase (Abb. 1d, e). Schließlich bewegen wir die Pipette schnell in der Luft nach oben, wodurch sich der Doppeltropfen aufgrund der viskosen Reibung der Agaroselösung von der Spitze löst (Abb. 1f).

Unmittelbar nach seiner Bildung ist der innere Wassertropfen somit von einer Ölschicht umgeben, die Phospholipide enthält. Diese Lipide verteilen sich daher an beiden Öl-Wasser-Grenzflächen neu, wobei ihre hydrophilen Köpfe auf der einen Seite der inneren Wasserphase und auf der anderen Seite der Agaroselösung zugewandt sind. Während die Agaroselösung abkühlt, sedimentiert der Doppeltropfen langsam in der Agaroselösung und bleibt schließlich im gebildeten Gel hängen. Während dieses Abkühlungsprozesses rahmt sich die Ölschicht des Doppeltropfens unter der Schwerkraft auf und bildet eine Ölkappe, während die Lipide, die die ehemaligen Öl/Wasser-Grenzflächen stabilisieren, eine Lipiddoppelschicht im unteren Teil des Tropfens bilden (Abb. 1g). Aus dem Doppeltröpfchen wird ein Pseudovesikel. Diese einfache Mikropipettenmethode ergibt Pseudovesikel mit einem Durchmesser von 601 \(\pm 58 \mu \)m (N = 98). Kleinere Größen können mit kleineren Spitzen und einem Mikroinjektor erreicht werden (siehe Abschnitt „Methoden“). Die Produktionsrate der Methode liegt bei etwa 5 Pseudovesikeln pro Minute und die Erfolgsquote liegt insgesamt bei etwa 30 %. Sobald das Pseudovesikel im Gel eingeschlossen ist, ist es mehrere Stunden lang stabil und kann über Nacht aufbewahrt werden, wenn die gelhaltige Küvette verschlossen ist, um eine Verdunstung zu verhindern. Darüber hinaus können Pseudovesikel, da sie im Gel eingeschlossen sind, leicht mit einem Mikroskop beobachtet werden, wie in32.

Um das Pseudovesikel zu charakterisieren und das Vorhandensein einer Lipiddoppelschicht zu untersuchen, verwendeten wir zunächst fluoreszierende Marker, die sowohl in der inneren wässrigen Phase dispergiert waren (Carboxyfluorescein, Emissionswellenlänge \(\lambda _c = 525\) nm, grün, siehe Abschnitt „Methoden“. ) und die Ölphase (Nilrot, Emissionswellenlänge \(\lambda _n = 636\) nm, rot). Das Pseudovesikel wird wie oben beschrieben im Agarosegel hergestellt und mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 4-fach-Objektiv weiter abgebildet. Die Fluoreszenzbilder sowohl des grünen als auch des roten Kanals werden aufgezeichnet (siehe Abb. 2a) und zeigen, dass die fluoreszierende Wasserphase effizient im Pseudovesikel eingekapselt ist. Zweitens fügten wir grün fluoreszierende Lipide (NBD-PC, 1 Gew.-%) zu der Lipidmischung hinzu, die in der mit Nilrot markierten Ölphase vorhanden war. Ein durch konfokale Mikroskopie erhaltenes zusammengesetztes Bild ist in Abb. 2b dargestellt. In Abb. 2c zeichnen wir für jeden Kanal die normalisierten radialen Intensitätsprofile (\((I(r)-I(0))/(I_{\textrm{cap}}+I(0))\) auf, wobei \ (I_{\textrm{cap}}\) ist die Intensität in der Ölkappe in einem bestimmten Kanal. Diese Profile zeigen einen signifikanten Anstieg des Fluoreszenzsignals, das von den Lipiden an der Grenze zwischen der inneren wässrigen Phase und dem äußeren Agarosegel entsteht . Im Gegenteil gibt es kein nachweisbares Fluoreszenzsignal aus der Ölphase, was darauf hindeutet, dass es in der Doppelschicht keine messbare Ölschicht gibt, bei der räumlichen Auflösung des konfokalen Mikroskops und an der Grenze unserer Fluoreszenzbildempfindlichkeit. Insgesamt unsere Ergebnisse bestätigen, dass die innere Phase effizient in einer Lipiddoppelschicht eingekapselt ist, die keine nennenswerten Mengen an Öl enthält. Dies schließt das Vorhandensein von Ölspuren im Submikrometerbereich in der Doppelschicht nicht aus, wie in durch Emulsionsmatrizen gebildeten Vesikeln nachgewiesen wird33. Dies war jedoch der Fall In34 wurde gezeigt, dass solche Ölrückstände in der Membran weder die mechanischen Eigenschaften noch die Funktionalität der Membran wesentlich beeinträchtigten. Die Membranspannung \(\gamma _b\) kann aus den Kontaktwinkeln der Ölkappe mit der wässrigen Phase und der Agarphase abgeschätzt werden (siehe ergänzende Informationen) und ergibt \(\gamma _b = 4,15 \pm 0,33\) mN/m ( erhalten aus 13 Bildern von N=8 Pseudovesikeln), was viel größer ist als die Werte, die üblicherweise in elektrogeformten Lipidvesikeln angegeben werden35,36, \(\gamma _b \sim 10^{-3}\) mN/m. Im Gegenteil, unser Membranspannungswert lässt sich gut mit denen vergleichen, die in Droplet Interface Bilayers (DIBs) erhalten werden, bei denen es sich um planare Lipiddoppelschichten handelt, die durch den Kontakt zweier wässriger Tröpfchen, die in einer Öl-Lipid-Mischung baden, erhalten werden (siehe z. B. 37, 38, 39). In DIBs gibt es auch Wasser/Öl-Grenzflächen rund um die Lipiddoppelschicht. Der hohe \(\gamma _b\)-Wert, den wir in unserem Pseudovesikel messen, ist daher, wie in DIBs, vermutlich auf das Vorhandensein der Ölkappe zurückzuführen, die die Doppelschicht auf beiden Seiten festhält und streckt.

Um das Vorhandensein einer Lipiddoppelschicht und ihre Funktionalität weiter zu untersuchen, haben wir \(\alpha \)-Hämolysin (\(\alpha \)HL)-Transmembranproteine ​​in die Lipiddoppelschicht eingefügt. \(\alpha \)HL ist eine heptamere Nanopore40, durch die Carboxyfluoresceinmoleküle diffundieren können41. In der Praxis stellten wir fest, dass die direkte Auflösung von \(\alpha \)HL-Monomeren in der inneren wässrigen Phase die Pseudovesikelstabilität aufgrund einer durch Nanoporen induzierten Änderung der Öl/Wasser-Oberflächenspannung verringerte (siehe ergänzende Informationen). Wir verwendeten daher kleine unilamellare Vesikel (SUV), die \(\alpha \)HL-Nanoporen enthielten, die primär hergestellt (siehe Abschnitt „Methoden“) und in der mit Carboxyfluorescein beladenen fluoreszierenden wässrigen inneren Phase dispergiert wurden. Das Pseudovesikel wird dann wie oben beschrieben gebildet, wodurch die in der inneren Phase enthaltenen SUVs mit der Doppelschicht verschmelzen können, wie zuvor in42 gezeigt. Diese Fusion ermöglicht wiederum die Einfügung funktioneller Transmembrankanäle in die Lipiddoppelschicht43,44, \(\alpha \)HL in unserem Fall (Abb. 2d). Unter einem Epifluoreszenzmakroskop haben wir das Austreten von Carboxyfluorescein durch das Pseudovesikel abgebildet, indem wir zwei Stunden lang alle 4 Minuten ein Bild aufgenommen haben. Wir führten Kontrollexperimente einerseits mit SUVs ohne \(\alpha \)HL-Nanoporen und andererseits mit Pseudovesikeln durch, die ohne SUVs oder \(\alpha \)HL hergestellt wurden. Mittels Bildanalyse haben wir die durchschnittliche Intensität innerhalb (bzw. außerhalb) des Pseudovesikels \(I_{in}\) (bzw. \(I_{out}\)) gemessen, aus der wir den Fluoreszenzintensitätskontrast \(\ Gamma = (I_{in}-I_{out})/(I_{in}+I_{out})\). Die zeitliche Variation des normalisierten Kontrasts \(\Gamma (t) / \Gamma (t=0)\) ist in Abb. 2e dargestellt. Offensichtlich nimmt der normalisierte Kontrast mit der Zeit für Pseudovesikel ab, die \(\alpha \)HL enthalten, während er für \(\alpha \)HL-freie Pseudovesikel konstant bleibt. Dies beweist, dass die Lipiddoppelschicht mit einem Transmembranprotein funktionalisiert werden kann. Quantitativer ausgedrückt erhalten wir durch Anpassen des normalisierten Kontrasts an einen exponentiellen Abfall (durchgezogene Linie in Abb. 2e) eine charakteristische Freisetzungszeit von \(5,9\pm 0,3~0,10^4\) s. Es wird erwartet, dass dieser Zeitrahmen mit dem Volumen des Vesikels skaliert45. Unter Berücksichtigung unserer großen Vesikelgröße stimmen unsere Ergebnisse gut mit den in der Literatur angegebenen Werten überein34,45,46.

(a) Zusammengesetztes konfokales Mikroskopbild eines Pseudovesikels, das in einem Agarosegel eingeschlossen ist. Die innere Phase enthält Carboxyfluorescein (grün), während die Ölphase Nilrot (rot) enthält. (b) Zusammengesetztes Bild, erhalten durch Zugabe von 1 Gew.-% fluoreszierendem NBD-PC zur Lipidmischung (grün) und einem Öl, das Nilrot enthält (rot). Gelbe Farbe = rote + grüne Kanäle. Aus Gründen der Klarheit wurde das Bild mit einem Gaußfilter mit einem Radius von 2 Pixeln geglättet. Maßstabsbalken = 200 \(\mu \)m. (c) Normalisiertes radiales Fluoreszenzintensitätsprofil, gemittelt über N=8 Pseudovesikel, markiert wie in (b). Die grünen Dreiecke (bzw. roten Scheiben) zeigen den fluoreszierenden Lipidkanal (bzw. fluoreszierenden Ölkanal). Fehlerbalken sind SE von Daten. \(R=316\pm 24\) \(\mu \)m ist die durchschnittliche Pseudovesikelgröße. (d) Skizze der \(\alpha \)HL-Insertion in die Pseudovesikelmembran unter Verwendung von \(\alpha \)HL-beladenem SUV. (e) Zeitliche Entwicklung des normalisierten Kontrasts \(\Gamma (t)/\Gamma (t=0)\) für \(\alpha \)HL-beladene Pseudovesikel (rote Scheiben, N=5) und Kontrollexperimente ohne \(\alpha \)HL (schwarze Quadrate, N=5). Fehlerbalken sind SD-Daten. Die durchgezogene Linie ist eine exponentielle Anpassung der Daten \(\Gamma (t)/\Gamma (t=0) = e^{-t/\tau } \ approx 1-t/\tau \), mit \(\ Tau = 5,9\pm 0,3~.10^4 s\).

Da das Pseudovesikel in der Masse des Agarosegels eingeschlossen ist, kann es durch Eindrücken der Geloberfläche deformiert werden (Abb. 3a). Wir komprimieren die Oberfläche des Gels mit einem quadratischen Kolben (Oberfläche S=1 \(\hbox {cm}^2\)), der an einem motorisierten Z-Translationstisch (Eindringungsamplitude, \(\Delta \)z = 1 mm) montiert ist , Abb. 3b–e), während die angelegte Normalkraft F gemessen wird (Abschnitt „Methoden“). Mit unserem Fluoreszenzmakroskop bilden wir ein Pseudovesikel ab, das Carboxyfluorescein enthält, während das Pseudovesikel zyklisch deformiert wird (Abb. 3b – d). Mithilfe der Bildanalyse passen wir eine Ellipse an die Pseudovesikelform an (wobei wir den Öldeckel aus der Analyse ausschließen, Abb. 3c). Die zeitliche Variation der langen a- und kurzen b-Achse der Ellipse ist in Abb. 3f dargestellt, aus der wir die Exzentrizität der Ellipse berechnen (e = \sqrt{1-b^2/a^2}\). Die Variation der Exzentrizität, \(\Delta e = e(F\ne 0)-e(F=0)\) kann als Proxy für die Dehnung verwendet werden. In Abb. 3g tragen wir die Druckspannung \(\sigma = F/S\) als Funktion von e ein. Es wird eine lineare Beziehung beobachtet, \(\sigma = K_e \Delta e\), mit einem effektiven Kompressionsmodul des Pseudovesikels \(K_e = 12,1\pm 0,6\) kPa. Der Wert von \(K_e\) unterscheidet sich deutlich vom Kompressionsmodul des Gels \(K_{gel} \ca. 85\) kPa (siehe Einschub in Abb. 3g). Darüber hinaus führten wir ergänzende Experimente durch (siehe ergänzende Informationen), die zeigten, dass das Vorhandensein der Ölkappe keinen Einfluss auf die Verformung der Pseudovesikel hatte. Unsere Methode bietet somit eine einfach zu verwendende Plattform zur Untersuchung der Lipiddoppelschichtmechanik oder Mechanotransduktionsprozesse.

(a) Skizze des mechanischen Anregungsaufbaus. (bd) Makroskop-Fluoreszenzbilder von Pseudovesikeln, entweder entspannt ((b) Z=0) oder deformiert (Z=0,5 bzw. 1 mm in (c,d). In (c) ist die rote Linie die Anpassung der Kontur des unteren Teils des Pseudovesikels an eine Ellipse. Maßstabsbalken = 400 \(\mu \)m. (e) Kolbenposition Z(t). (f) Hauptachse (rot) und Nebenachse (blau) der angepassten Ellipse als Funktion der Zeit für einen 1000 s langen zyklischen Einzug. (g) Druckspannung \(\sigma \) als Funktion der Exzentrizität e der Ellipse. Graue Kreuze entsprechen allen Datenpunkten aus (f), schwarze Kreise sind Durchschnittswerte innerhalb der Exzentrizitätsbereiche \(\delta e\)= 0,01. Fehlerbalken sind SD der Daten. Die rot gepunktete Linie ist eine lineare Anpassung an die Daten. Einschub: Normalkraft als Funktion des Kolbeneindrucks. Die Linie ist eine lineare Anpassung \(F=\kappa z\), aus der der Gelkompressionsmodul abgeleitet werden kann, \(K_{Gel}=\kappa H/S\), wobei H die Höhe des Gels ist.

Insgesamt stellt unser Ansatz eine sehr einfache Methode zur Herstellung und Einfangung von Pseudovesikeln in einem Gel dar, die einfach einzurichten und kostengünstig ist. Einerseits erfordert die Methode nur kleine Volumina der eingekapselten Phase (\(\sim \) 1 \(\mu \)L der Probe), im Gegensatz zu üblichen mikrofluidischen Techniken21, die normalerweise Hunderte von Mikrolitern Lösungen erfordern Erhalten Sie stabile Flüsse. Andererseits basiert es auf einer sanften Manipulation und vermeidet so jegliche Denaturierung von Proteinen, die durch die Anwendung elektrischer Felder18,19 wie bei Elektroformationstechniken verursacht werden kann. Dies macht es besonders interessant für die Verwendung wertvoller und empfindlicher biologischer Proben. Beachten Sie jedoch, dass der geschätzte Wert der Membranspannung in unserem System viel größer ist als die Werte, die normalerweise für elektrogeformte Vesikel angegeben werden, was vermutlich auf das Vorhandensein der Ölkappe zurückzuführen ist, die die Doppelschicht auf beiden Seiten festhält und streckt. Dieser Effekt sollte bei weiteren Anwendungen der Methode berücksichtigt werden. Da die Pseudovesikel schließlich in einem Gel eingeschlossen sind, sind sie leicht zu lokalisieren und erfordern im Gegensatz zu Emulsionstemplate-Methoden keine Nachbearbeitung. Die Pseudovesikel können auch leicht durch Eindrücken der Geloberfläche verformt werden, was eine Feinabstimmung sowohl der Spannungsamplitude als auch der Spannungsfrequenz ermöglicht. Abschließend werden die Pseudovesikel in ein viskoelastisches Gel eingebettet, das die mechanischen Eigenschaften biologischer Gewebe besser nachahmt.

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Chemikalien von Sigma Aldrich, Merk Inc. gekauft.

Die innere wässrige Phase des Doppeltropfens enthält 10 mM Tris-Puffer (pH=7,5), 400 mM Saccharose und 100 mg/ml Dextran (\(\hbox {M}_w\)=40,10\(^3\) g/ mol,). Für fluoreszierende Pseudovesikel haben wir diesem Puffer 20 \(\mu \)M Carboxyfluorescein hinzugefügt. Die Osmolarität der inneren Phase, gemessen mit einem Löser TYP6-Osmometer, beträgt etwa 600 mOsm.

Die äußere Phase besteht aus 3 Gew.-% Agarose mit niedriger Geliertemperatur, gelöst in einem Puffer, der 10 mM Tris (pH = 7,5) und 200 mM Kaliumchlorid enthält. Vor der Agarose-Zugabe stellen wir die Osmolarität auf 380 mosm ein. Anschließend wird Agarose im Puffer auf einer Heizplatte gelöst und die resultierende Lösung bei 85 °C in flüssiger Form gehalten.

Die Ölphase ist eine 50/50-Gew./Gew.-Mischung aus Hexadecan und Silikonöl AR20, in der getrocknete Lipide gelöst sind. Die in45 beschriebene Lipidmischung imitiert die bakterielle Membranzusammensetzung und maximiert ihre Stabilität in den Doppelschichtgeometrien der Tröpfchenschnittstelle. Es besteht aus 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC, 81,1 Gew.-%), 1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPhPC, 10,8 Gew.-%) und 1,2-Dioleoyl -sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (Natriumsalz) (DOPG, 5,4 Gew.-%) und Cholesterin (2,7 Gew.-%). Beachten Sie, dass eine so hohe DOPC-Konzentration die Bildung von Lipiddomänen sowohl in der Doppelschicht47,48 als auch an der Öl/Wasser-Grenzfläche49 verhindert. In der Praxis bereiten wir eine Lösung von 7,4 mg dieser Lipidmischung in Chloroform vor. Anschließend werden die Lipide unter Stickstoff getrocknet und mehrere Wochen lang in einem 2-ml-Fläschchen unter inerter Atmosphäre bei -20 °C aufbewahrt. Unmittelbar vor der Verwendung geben wir 2 ml der Ölphase hinzu, um eine Gesamtlipidkonzentration von 3,7 mg/ml zu erreichen, und stellen das Fläschchen 30 Minuten lang in ein Ultraschallbad bei 30 °C. Diese Öl-Lipid-Mischung kann dann einige Tage lang verwendet werden.

Für die konfokale Bildgebung haben wir die Ölphase und die Phospholipide getrennt gekennzeichnet. Die Ölphase wird mit Nilrot nach folgendem Verfahren markiert: Eine kleine Menge festes Nilrot (normalerweise die Spitze eines Spatels) wird in 300 μl Aceton gelöst. Anschließend werden 5 ml Silikonöl auf das Aceton gegossen und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, um den Nilrot-Farbstoff in die Ölphase zu überführen und gleichzeitig alle Lösungsmittelspuren zu verdampfen.

Zur Markierung der Lipiddoppelschicht wurden fluoreszierende Lipide nach dem oben genannten Verfahren in die Lipidmischung eingearbeitet. Wir verwenden 1-Myristoyl-2-[12-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]dodecanoyl]-sn-Glycero-3-Phosphocholin oder NBD-PC-Lipide, die angeregt werden 480 nm, wodurch wir gleichzeitig die mit Nilrot markierte Ölphase und die mit NBD-PC markierte Lipiddoppelschicht abbilden konnten. In diesem Fall ergeben die endgültigen Lipidkonzentrationen in der Mischung: 80,3 Gew.-% DOPC, 10,7 Gew.-% DPhPC, 2,7 Gew.-% Cholesterin, 5,4 Gew.-% DOPG, 1 Gew.-% NBD-PC.

Die oben genannte Lipidmischung (Gesamtlipidmasse 1,25 mg) wird unter Stickstoff in einem Reagenzglas getrocknet und über Nacht in einer Vakuumkammer weiter trocknen gelassen. Am nächsten Tag wird 1 ml der inneren wässrigen Phase zum Lipidfilm gegeben und die Lösung 30 Minuten lang in einen Sonden-Ultraschallgerät gegeben, wobei Ein-/Aus-Zyklen von jeweils 15/5 Sekunden verwendet werden.

\(\alpha \)HL-Monomere werden im internen wässrigen Puffer in einer Konzentration von 250 \(\mu \)g/ml hergestellt. Um ein mit \(\alpha \)HL-Nanoporen dekoriertes SUV zu erhalten, wurden 30 \(\mu \)L dieser \(\alpha \)HL-Lösung zu 120 \(\mu \)L der SUV-Lösung hinzugefügt, was eine endgültige Porenmonomerkonzentration von 50 \(\mu \)g/ml ergibt. Die resultierende Mischung wird etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und als innere Phase der Pseudovesikel verwendet.

Das Öl-/Wasserphasen-Sandwich wird nach den im Haupttext beschriebenen Schritten hergestellt. Die warme Agaroselösung wird in eine Spektrophotometerküvette (Abmessungen 10x10x40 \(\hbox {mm}^{3}\)) gegossen. Die Temperatur der Agarose wird mit einem Temperaturthermoelement (USB-TC01, National Instrument) gemessen. Wenn die Temperatur etwa 38 °C erreicht, bildet sich der Doppeltropfen. Das System lässt man etwa 15 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen, sodass die Agarosegele um das Pseudovesikel herum gelieren. Beachten Sie, dass die Methode grundsätzlich in flüssigen (Agarose-freien) Umgebungen eingesetzt werden kann, was die Verwendung von Techniken zur Entfernung von Ölkappen ermöglichen würde, wie in22,23,24 beschrieben. In unseren ersten Versuchen destabilisierten jedoch die hohen Sedimentationsgeschwindigkeiten der erzeugten Tröpfchen (die groß und deutlich dichter als die äußere Phase waren) die Pseudovesikel während ihrer Bildung. Die Verringerung der Pseudovesikelgröße (durch Verwendung eines kleineren Durchmessers der Injektionsspitze), die Anpassung der Dichte der inneren Phase oder die Erhöhung der Viskosität der äußeren Phase verringern die Sedimentationsgeschwindigkeit des erzeugten Doppeltröpfchens und scheinen ein vielversprechender Weg zur Gewinnung stabiler Pseudovesikel zu sein in flüssigen Umgebungen.

Für mechanische Anregungsexperimente in Agarose wird vor dem Eingießen der flüssigen Agarose eine dünne rechteckige Plexiglasplatte (Breite 1 mm) auf einer Seite der Küvette angebracht, um deren Wand abzudecken. Während die Agarose geliert, wird diese Folie vorsichtig entfernt, sodass zwischen dem Agarosegel und der Küvettenwand ein freier Raum verbleibt. Tatsächlich kommt es aufgrund des Poisson-Effekts zu einer seitlichen Ausdehnung des Gels, wenn es vertikal komprimiert wird. Dieser Leerraum ist erforderlich, um diese seitliche Ausdehnung und eine ordnungsgemäße elastische Verformung des Gels zu ermöglichen.

Die Küvette wird auf dem in Abb. 3a dargestellten Gerät platziert und fixiert. Der Kolben wurde 3D-gedruckt, um auf die Küvettengröße zu passen, und eine dünne Plexiglasplatte wird auf die Kolbenfläche geklebt, um die Agaroseoberfläche einzudrücken. Der Kolben ist auf einem Translationstisch montiert, der von einem Newport LTA-HL-Linearaktuator (Z-Auflösung von 1 \(\mu \)m) gesteuert wird. Wenn der Kolben das Gel eindringt, lenkt er die beiden planaren Ausleger ab, die an der Basis des Probenhalters befestigt sind. Ein kapazitiver Sensor misst die Auslenkung der Ausleger. Wenn wir die Steifigkeit dieser Ausleger kennen (aus vorheriger Kalibrierung), leiten wir die angelegte Normalkraft F ab (das Messrauschen auf F beträgt 1 mN).

Der erste Schritt der Eindringexperimente besteht in der Bestimmung der Geloberflächenposition. Dazu wird die Z-Position des Kolbens unter Messung der Normalkraft in Schritten von 0,1 mm abgesenkt. Wenn die Kraft 5 mN erreicht, wird die Rampe gestoppt und diese Z-Position wird als Ursprung für die Z-Koordinaten verwendet.

Anschließend erzwingen wir eine zyklische Verformung der Gele, indem wir das Gel von dieser Oberflächenposition aus um einen Wert \(\Delta Z\) in Schritten von 100 \(\mu \)m eindrücken. Bei jedem Schritt wird die Kraft gemessen. Das Pseudovesikel wird bei jedem Eindruckschritt (unter Verwendung eines blauen Lichtimpulses, Dauer 500 ms) mit einem Leica-Makroskop und einer Pointgrey-Kamera (BFLY-U3-23S6C-C) abgebildet.

Um kleinere Pseudovesikelgrößen zu erreichen, verwenden wir eine kleinere Injektionsspitze. In der Praxis verwenden wir einen Polyurethanschlauch (Phymep) mit einem Außendurchmesser von 240 \(\mu \)m und einem Innendurchmesser von 130 \(\mu \)m. Der Schlauch ist mit einer 50 \(\mu \)L-Spritze (Hamilton) verbunden, die auf einem selbstgebauten Mikroinjektor montiert ist. Die Pseudovesikel werden im Agarosegel mit dem fluoreszierenden Innenpuffer hergestellt und durch Epifluoreszenz abgebildet. Wir bestimmen ihre Größe mittels Bildanalyse und finden einen durchschnittlichen Durchmesser \(D= 410 \pm 45 \mu \)m (N=6). Im Prinzip könnten kleinere Größen durch die Verwendung einer kleineren Injektionsspitze erreicht werden. Die einzige experimentelle Schwierigkeit wird darin bestehen, das Öl/Wasser-Sandwich zu bilden. Die Verwendung eines handelsüblichen Mikroinjektors ist erforderlich.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. Korrespondenz und Anfragen nach Rohdaten und Materialien sind an EW oder L.-LP zu richten

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Die Autoren danken Mathieu Letrou und Sophie Cribier für ihre wertvolle Hilfe bei der SUV-Vorbereitung. EW dankt der Emergence Sorbonne University für finanzielle Unterstützung, LLP dankt der Agence Nationale de la Recherche (BOAT, ANR-17-CE30-0001) und Emergence(s) Ville de Paris für die finanzielle Unterstützung.

Universität Sorbonne, CNRS, Institut für Biologie Paris-Seine (IBPS), Jean Perrin Laboratory (LJP), 4 Place Jussieu, 75005, Paris, Frankreich

Pierre Tapie, Alexis M. Prevost, Lorraine Montel, Léa-Laetitia Pontani und Elie Wandersman

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EW und LLP konzipierten das Projekt und die Experimente, analysierten die Ergebnisse und schrieben die Arbeit, PT sammelte die experimentellen Daten, analysierte die Ergebnisse und überprüfte das Manuskript. LM beteiligte sich an der Sammlung der experimentellen Daten, analysierte die Ergebnisse und überprüfte das Manuskript. AP beteiligte sich an der Entwicklung des Versuchsaufbaus, analysierte die Ergebnisse und überprüfte das Manuskript.

Korrespondenz mit Léa-Laetitia Pontani oder Elie Wandersman.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tapie, P., Prevost, AM, Montel, L. et al. Eine einfache Methode, um ein Vesikel in einem Gel herzustellen, einzuschließen und zu verformen. Sci Rep 13, 5375 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31996-9

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Eingegangen: 13. Juli 2022

Angenommen: 21. März 2023

Veröffentlicht: 02. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31996-9

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